浙江外泌體熒光標(biāo)記

超速離心是外泌體提取較常用的方法也被認(rèn)為是金標(biāo)準(zhǔn)，主要是根據(jù)外泌體的沉降系數(shù)、大小和形狀將其分離出來。首先4℃低速離心（300-500g，10min）去除死細(xì)胞以及細(xì)胞碎片，隨后以較高離心速度(2000xg，10min)去除生物聚合物以及凋亡小體，然后用10000xg,30min離心去除大型囊泡，結(jié)尾以超速離心沉淀外泌體。通過懸浮以及重復(fù)超速離心去除外泌體沉淀中的非外泌體蛋白。超速離心法具有操作簡單、不易被分離試劑污染、獲得的外泌體數(shù)量較多等優(yōu)點(diǎn)。但是此方法需要昂貴的超高速離心機(jī)，每次處理的樣本量較小，費(fèi)時(shí)，電鏡鑒定時(shí)還發(fā)現(xiàn)外泌體易聚集成塊，且上清中仍能檢測到大型囊泡，純度不高，另外高速離心會(huì)損傷外泌體影響下游實(shí)驗(yàn)。外泌體具有抗原提呈、免疫逃逸、誘導(dǎo)正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化、促進(jìn)瘤子發(fā)生和轉(zhuǎn)移等作用。浙江外泌體熒光標(biāo)記

外泌體是細(xì)胞分泌到胞外的一種囊泡，其大小為30-150nm，具有雙層膜結(jié)構(gòu)和茶托狀形態(tài)，含有豐富的內(nèi)含物（包括核酸、蛋白和脂質(zhì)等），參與細(xì)胞間的分子傳遞。外泌體普遍存在于細(xì)胞培養(yǎng)上清以及各種體液中，包括血液、唾液、尿液、乳汁等，同時(shí)也存在于組織樣本中，如腦組織、肌肉組織、脂肪組織等。所有的細(xì)胞都能分泌外泌體，但是不同細(xì)胞分泌的外泌體不管在數(shù)量上還是在內(nèi)含物中都具有比較大的差異性，這也決定了每種外泌體所行使的功能不一樣。外泌體普遍參與細(xì)胞間物質(zhì)運(yùn)輸與信息傳遞，調(diào)控細(xì)胞生理活動(dòng)。同時(shí)，外泌體具有抗原提呈、免疫逃逸、誘導(dǎo)正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化、促進(jìn)瘤子發(fā)生和轉(zhuǎn)移等作用；此外，外泌體還可以作為“天然的納米粒子”來進(jìn)行藥物遞送。外泌體的膜蛋白有可能與細(xì)胞膜蛋白作用，活躍細(xì)胞內(nèi)通路。上海外泌體Dil在研究和評估外泌體的副作用和功效時(shí)，必須考慮到肉瘤細(xì)胞來源的外泌體可能增強(qiáng)肉瘤生長的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）：將其中一種針對外泌體表面抗原的抗體固定在微孔板的表面上，將外泌體樣品暴露于含有固定抗體的孔中，由于抗體-抗原相互作用，表達(dá)抗原的外泌體將被捕獲固定在板上。將未捕獲的樣品內(nèi)容物洗掉，并使用另一種抗體檢測固定的外泌體。ELISA已用于從尿液、血漿和血清中分離出外泌體，當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)液（已知外泌體的量）創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，甚至可以進(jìn)行定量。但是，此方法需要通過超速離心或超濾對樣品進(jìn)行預(yù)處理。同樣，流場-流分離與紫外線分析儀和光散射檢測器相結(jié)合已被用于分析外泌體的大小和純度。

常規(guī)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)（RT-PCR）普遍用于microRNA的檢測實(shí)踐中，但外泌體樣品中的microRNA豐度極低，普通RT-PCR技術(shù)的靈敏度已經(jīng)不能夠滿足。第三代微滴式數(shù)字PCR——ddPCR技術(shù)，成為外泌體microRNA檢測的選擇技術(shù)。微滴式數(shù)字PCR（DropletdigitalPCR），又成為“油包水PCR”，在傳統(tǒng)的PCR擴(kuò)增前對樣品進(jìn)行微滴化處理，即將含有核酸分子的反應(yīng)體系分成成千上萬個(gè)納升級的微滴，其中每個(gè)微滴或不含待檢核酸靶分子，或者含有一個(gè)至數(shù)個(gè)待檢核酸靶分子。經(jīng)PCR擴(kuò)增后，逐個(gè)對每個(gè)微滴進(jìn)行檢測，有熒光信號的微滴判讀為1，沒有熒光信號的微滴判讀為0，根據(jù)泊松分布原理及陽性微滴的個(gè)數(shù)與比例即可得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度。外泌體的提取的方式：過濾離心。

磁珠免疫法分離外泌體：將針對目的抗原的抗體通過生物素-鏈霉親和素連接到磁珠表面，然后將磁珠與樣品共孵育，使外泌體特異性結(jié)合到磁珠上形成磁珠-外泌體復(fù)合物，再用蒸餾水或者PBS沖洗，結(jié)尾用甘氨酸-Tris-HCl溶液洗脫獲得外泌體。該方法相對于ELISA的好處主要是，珠粒提供了更大的表面積來捕獲外泌體，從而提高了分離效率。此外，使用磁珠時(shí)，樣品起始體積沒有上限，而基于微孔板的ELISA分析的較大樣品體積為100μL，且ELISA洗脫雜質(zhì)時(shí)容易造成孔間交叉污染。當(dāng)將磁珠法與金標(biāo)準(zhǔn)外泌體分離方法進(jìn)行比較時(shí)，磁珠法可分離出更純凈的外泌體，特異性高、速度更快，并且不需要昂貴的儀器。另外，與其他分離方法（如超速離心或超濾）相比，磁珠法不影響外泌體形態(tài)。但是采用磁珠法時(shí)，外泌體生物活性易受PH和鹽濃度影響。干細(xì)胞外泌體攝取流式細(xì)胞技術(shù)是細(xì)胞和小顆粒定性和定量表征的有效方法。研究所外泌體提取試劑盒應(yīng)用

需要開發(fā)大規(guī)模生產(chǎn)質(zhì)量可控的外泌體并快速純化外泌體的技術(shù)和策略。浙江外泌體熒光標(biāo)記

外泌體的提取主要包括以下幾種方式：1、免疫磁珠法，這種方法可以保證外泌體形態(tài)的完整，特異性高、操作簡單、不需要昂貴的儀器設(shè)備，但是非中性pH和非生理性鹽濃度會(huì)影響外泌體生物活性，不便進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)。2、PS親和法，該方法將PS（磷脂酰絲氨酸）與磁珠結(jié)合，利用親和原理捕獲外泌體囊泡外的PS。該方法與免疫磁珠法相似，獲得的外泌體形態(tài)完整，純度較高。由于不使用變性劑，不影響外泌體的生物活性，外泌體可用于細(xì)胞共培養(yǎng)和體內(nèi)注射。3、色譜法，這種方法分離到的外泌體在電鏡下大小均一，但是需要特殊的設(shè)備，應(yīng)用不普遍。浙江外泌體熒光標(biāo)記

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