CTNT免疫熒光

熒光素標記抗體的方法：方法及步驟：①抗體的準備：取適量已知球蛋白濃度之溶液，置入三角燒瓶中，加入生理鹽水及碳酸鹽緩沖液，使然后蛋白濃度為20mg/ml，緩沖液容量為總量的1/10，混勻，將三角燒瓶置冰槽中，電磁攪拌（速度適當以不起泡沫為宜）5～10min。②熒光素的準備：根據(jù)欲標記的蛋白質總量，按每毫克蛋白加0.01mg熒光素，用分析天平準確稱所取所需的異硫氰酸熒光素粉末。③結合（或稱標記）：邊攪拌邊將稱取的熒光色素漸漸加入球蛋白溶液中，避免將熒光素粘于三角燒瓶壁或攪拌玻棒上（大約5～10min內加完），加畢后，繼續(xù)攪拌12～18h。結合期間應保持蛋白溶液于4℃左右，故須及時添冰去水；亦可將結合裝置安放在4℃冰箱或冰庫中。免疫熒光技術可以用于研究細胞內分子的相互作用。CTNT免疫熒光

檢測復雜的生物學結構需要較高清晰度的熒光信號，并將熒光信號從背景噪聲中分離開來。標準的免疫熒光標記很少能夠獲得較佳信噪比的成像效果。獲得良好圖片和較佳的可供發(fā)表的高質量圖像之間的差異就在于：需要精細調整樣品信號達到峰值特異性、高清晰度和較佳放大倍數(shù)。雖然熒光基團是進行高質量細胞成像的較佳選擇，但不可避免地也極易發(fā)生光漂白，即熒光信號的光化學降解或衰退。任何光敏感度的下降都可能導致數(shù)據(jù)出現(xiàn)偏差，產生假性結果?？勾銣绶馄瑒┛梢员Ｗo熒光標記蛋白的穩(wěn)定性，維持數(shù)周乃至數(shù)月的圖像信號完整度。ALBUMIN免疫熒光染色免疫熒光技術在免疫學研究中發(fā)揮重要作用，幫助揭示細胞和分子的功能和相互關系。

免疫熒光注意事項：對照實驗的設置：1、內源性組織背景對照：某些細胞和組織可能有固有的生物學性質，會產生背景熒光，對結果產生影響，例如色素脂褐質。因此在孵育一抗前，應對樣品進行觀察，確?？乖旧頉]有信號。2、陽性對照：用確認含有待測抗原的組織或細胞，與待測標本進行統(tǒng)一處理，結果應為陽性，可證明待測抗原有一定活性并且實驗過程中用的試劑及方法均可靠。3、陰性對照：與陽性對照相反，用明確不含有待測抗原的細胞或組織切片染色，結果若為陰性，可排除染色過程中由于非特異性染色造成的假陽性結果。

細胞爬片的免疫熒光步驟基本一致：1. 取出細胞爬片放到35mm或60mm用過的細胞培養(yǎng)皿里，PBS洗三遍。注意：有的時候作的細胞爬片可能比較小，因此夾取的時候要小心，注意 反正面，放在皿里洗比較方便，避免了來回夾取，另外洗的時候加PBS不要太沖，不要細胞沖下來。洗的時候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，沒有等5分鐘或10分鐘。2. 4%冷的多聚甲醛固定20分鐘，PBS洗三遍。3. 0.2%Triton X-100通透10分鐘，PBS洗三遍。4. 與二抗相同宿主的血清封閉30分鐘，PBS洗三遍。5. 一抗4度濕盒內過夜，也可37度2小時，感覺前者效果好，PBS洗三遍。6. 二抗室溫2小時(避光)，或者37度1半小時，PBS洗三遍。7. 較好用DAPI染核，然后直接照熒光片。8. 蒸餾水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因為甘油不象樹脂那樣會干，所以不用指甲油封的話會弄的一塌糊涂。免疫熒光技術通過熒光信號的觀察來確定抗原或抗體的分布和定位。

細胞免疫熒光實驗注意事項：根據(jù)所檢測抗原所在位置來確認是否需要加入 Triton 進行通透。若所檢測抗原表位位于膜蛋白的白外段，則不需要通透；一般 5% BSA 封閉即可達到效果；從加熒光二抗起，后面所有操作步驟盡量避光?？s短在熒光顯微鏡下的觀察時間，1~2 h 為宜。染色后盡快熒光顯微鏡下觀察，若不能可放入 4 ℃ 冰箱避光保存一周。無/弱染色：烤片溫度過高，推薦 56~60 ℃ 1~2 h；一抗是否適用固定液和石蠟切片，使用濃度是否過低，孵育是否時間過短等。免疫熒光技術可以用于研究細胞遷移和細胞黏附。ALBUMIN免疫熒光染色

免疫熒光技術可以用于研究藥物的靶點和作用機制。CTNT免疫熒光

免疫熒光技術又稱熒光抗體技術，是標記免疫技術中發(fā)展較早的一種。它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。很早以來就有一些學者試圖將抗體分子與一些示蹤物質結合，利用抗原抗體反應進行組織或細胞內抗原物質的定位。免疫熒光技術是標記免疫技術中發(fā)展較早的一種．它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。Coons等于1941年初次采用熒光素進行標記抗體獲得成功。經過幾十年的發(fā)展，該技術已相當成熟。用熒光抗體示蹤或檢查相應抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光抗原標記物示蹤或檢查相應抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術。在實際工作中熒光抗原技術很少應用，所以人們習慣將熒光抗體技術稱為免疫熒光技術CTNT免疫熒光

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