檢測(cè)復(fù)雜的生物學(xué)結(jié)構(gòu)需要較高清晰度的熒光信號(hào),并將熒光信號(hào)從背景噪聲中分離開來。標(biāo)準(zhǔn)的免疫熒光標(biāo)記很少能夠獲得較佳信噪比的成像效果。獲得良好圖片和較佳的可供發(fā)表的高質(zhì)量圖像之間的差異就在于:需要精細(xì)調(diào)整樣品信號(hào)達(dá)到峰值特異性、高清晰度和較佳放大倍數(shù)。雖然熒光基團(tuán)是進(jìn)行高質(zhì)量細(xì)胞成像的較佳選擇,但不可避免地也極易發(fā)生光漂白,即熒光信號(hào)的光化學(xué)降解或衰退。任何光敏感度的下降都可能導(dǎo)致數(shù)據(jù)出現(xiàn)偏差,產(chǎn)生假性結(jié)果??勾銣绶馄瑒┛梢员Wo(hù)熒光標(biāo)記蛋白的穩(wěn)定性,維持?jǐn)?shù)周乃至數(shù)月的圖像信號(hào)完整度。免疫熒光技術(shù)是一種利用熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體來定位抗原的技術(shù)。GFP免疫熒光染色
細(xì)胞免疫熒光可以觀察蛋白在細(xì)胞中的定位,以及一些特殊信號(hào)分子蛋白的出核/入核的定位變化。在進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光過程中,需要用到細(xì)胞爬片,通過將爬片浸在細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi),細(xì)胞在爬片上生長,進(jìn)而進(jìn)行細(xì)胞的免疫熒光。實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備:1.胰酶;2.DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基;3.細(xì)胞培養(yǎng)12孔板或者6孔板;4.爬片。間接免疫熒光的優(yōu)點(diǎn):通過增加能夠與一抗結(jié)合的二抗數(shù)量進(jìn)行信號(hào)放大;與直接免疫熒光相比,通過信號(hào)放大提高檢測(cè)靈敏度。免疫熒光技術(shù)是一種以熒光素標(biāo)記抗體來定位抗原物質(zhì)的高度發(fā)達(dá)的標(biāo)記免疫技術(shù)。FOXP3免疫組化免疫熒光技術(shù)可以用于研究動(dòng)物模型和藥物篩選。
熒光色素:四甲基異硫氰酸羅丹明(tetramethylrhodamineisothiocyanate,TRITC)結(jié)構(gòu)式如下:較大吸引光波長為550nm,較大發(fā)射光波長為620nm,呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對(duì)比鮮明,可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?。其異硫氰基可與蛋白質(zhì)結(jié)合,但熒光效率較低。免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù),是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù)。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合,利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。
基于熒光成像的技術(shù)對(duì)于查詢細(xì)胞和組織的結(jié)構(gòu)和功能方面非常有用。當(dāng)與免疫化學(xué)結(jié)合時(shí),熒光成像技術(shù)的分析能力增加,增強(qiáng)了這種技術(shù)在普遍的研究和臨床應(yīng)用中的實(shí)用性,使其成為寶貴的工具。免疫熒光顯微鏡通過使活細(xì)胞成像能夠可視化整個(gè)細(xì)胞器,徹底改變了細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域。免疫組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)是結(jié)合抗原抗體結(jié)合能力進(jìn)行細(xì)胞分析的常用熒光成像技術(shù)。免疫熒光(IF)是一種強(qiáng)大的免疫染色技術(shù),利用顯微鏡觀察與靶蛋白和其他目標(biāo)分子結(jié)合的熒光素標(biāo)記抗體。免疫熒光用于鑒定細(xì)胞中的細(xì)胞和組織特異性抗原;可視化蛋白質(zhì)的存在與否、細(xì)胞定位和活化狀態(tài);并分析免疫反應(yīng)。免疫熒光技術(shù)可以用于研究內(nèi)臟移植和免疫抑制。
細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng):1、建議細(xì)胞直接種孔板,采用倒置熒光顯微鏡拍照,這樣可以避免然后挑片時(shí)造成劃片或細(xì)胞片破損以及然后封片可能造成滑片等結(jié)果;2、若實(shí)驗(yàn)室只有正置熒光顯微鏡,則需要將細(xì)胞植于細(xì)胞爬片。建議直接購買處理過的細(xì)胞爬片;若只有普通細(xì)胞爬片,可以先將爬片于濃酸(濃酸腐蝕性強(qiáng),注意操作)或 75% 乙醇浸泡過夜,若用酸浸泡過夜,第二天先用自來水小心沖洗掉爬片殘留的酸液,若用 75% 乙醇浸泡,則不需要此步驟。然后,用洗潔精搓洗爬片,然后用去離子水清洗爬片。置于烘箱 80 ℃ 烘干,再將爬片置于超凈臺(tái)造紫外消毒后備用。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞遷移和細(xì)胞黏附。GFP免疫熒光分析
使用熒光抗體方法是免疫熒光技術(shù)中常見的操作步驟。GFP免疫熒光染色
細(xì)胞的固定及免疫熒光:1)吸除培養(yǎng)基,一般先加入PBS浸洗細(xì)胞 3 次,每次 5 min。2)向孔內(nèi)加入4%多聚甲醛1ml,進(jìn)行細(xì)胞固定,室溫固定20分鐘。3)吸去多聚甲醛,使用PBS浸洗 3 次,每次 5 min。4)向孔內(nèi)加入0.5%Triton X-100(PBS配制)室溫通透20min,目的是使細(xì)胞通透。5) 除去Triton X-100,使用PBS浸洗 3 次,每次 5 min。6)用10%的與二抗同源的山羊血清(PBS配制)或者5%BSA封閉2小時(shí)(選擇的封閉液與后面操作過程中抗體稀釋液一致)。封閉后不需要用PBS清洗。7)吸去封閉液,向每孔滴加足夠量適宜濃度的一抗(一次使用抗體可以根據(jù)抗體說明書推薦濃度,后續(xù)實(shí)驗(yàn)可以摸索抗體的適宜濃度),4℃濕盒內(nèi)孵育過夜。GFP免疫熒光染色
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