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免疫熒光間接法：如檢查未知抗原，先用已知未標(biāo)記的特異抗體（一抗體）與抗原標(biāo)本進(jìn)行反應(yīng)，用水洗去未反應(yīng)的抗體，再用標(biāo)記的抗抗體（第二抗體）與抗原標(biāo)本反應(yīng)，使之形成抗體—抗原—抗體復(fù)合物，再用水洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗體，干燥、封片后鏡檢。如果檢查未知抗體，則表明抗原標(biāo)本是已知的，待檢血清為一抗體，其它步驟的抗原檢查相同。標(biāo)記的抗抗體是抗球蛋白抗體，同于血清球蛋白有種的特異性，如免疫抗雞血清球蛋白只對(duì)雞的球蛋白發(fā)生反應(yīng)，因此，制備標(biāo)記抗體適用于任何抗原的診斷。免疫熒光技術(shù)在免疫學(xué)研究中發(fā)揮重要作用，幫助揭示細(xì)胞和分子的功能和相互關(guān)系。CD45免疫組化IHC

免疫熒光實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)：為了保證熒光染色的正確性，初次試驗(yàn)時(shí)需設(shè)置下述對(duì)照，以排除某些非特異性熒光染色的干擾。①標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照：標(biāo)本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。②特異性對(duì)照（抑制試驗(yàn)）：標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體，再加熒光標(biāo)記的特異性抗體。③陽(yáng)性對(duì)照：已知的陽(yáng)性標(biāo)本加熒光標(biāo)記的特異性抗體。如果標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照和特異性對(duì)照呈無(wú)熒光或弱熒光，陽(yáng)性對(duì)照和待檢標(biāo)本呈強(qiáng)熒光，則為特異性陽(yáng)性染色。一般標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過(guò)3min，就有熒光減弱現(xiàn)象，經(jīng)熒光染色的標(biāo)本較好在當(dāng)天觀察，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光強(qiáng)度會(huì)逐漸下降。insulin免疫熒光分析免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞凋亡和細(xì)胞存活。

免疫熒光實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)：對(duì)熒光標(biāo)記的抗體的稀釋，要保證抗體的蛋白有一定的濃度，一般稀釋度不應(yīng)超過(guò)1：20，抗體濃度過(guò)低，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生的熒光過(guò)弱，影響結(jié)果的觀察。染色的溫度和時(shí)間需要根據(jù)各種不同的標(biāo)本及抗原而變化，染色時(shí)間可以從10min到數(shù)小時(shí)，一般30min已足夠。染色溫度多采用室溫（25℃左右），高于37℃可加強(qiáng)染色效果，但對(duì)不耐熱的抗原（如流行性乙型腦炎病毒）可采用0-2℃的低溫，延長(zhǎng)染色時(shí)間。低溫染色過(guò)夜較37℃30min效果好的多。

熒光色素：四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）結(jié)構(gòu)式如下：較大吸引光波長(zhǎng)為550nm，較大發(fā)射光波長(zhǎng)為620nm，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對(duì)比鮮明，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?。其異硫氰基可與蛋白質(zhì)結(jié)合，但熒光效率較低。免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)。很早以來(lái)就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。免疫熒光技術(shù)可以用于研究藥物的靶點(diǎn)和作用機(jī)制。

通過(guò)不同顏色熒光標(biāo)記不同的靶標(biāo)，可以直觀的觀察同一樣品細(xì)胞內(nèi)不同結(jié)構(gòu)和蛋白。熒光標(biāo)記靶標(biāo)的方法主要包括熒光染料、免疫標(biāo)記、熒光融合蛋白等——這幾種方法均可選擇性標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)和蛋白，讓您在成像時(shí)更輕松地進(jìn)行觀察。細(xì)胞生物學(xué)采用的很多熒光工具基本上都是熒光基團(tuán)。這些熒光基團(tuán)經(jīng)過(guò)不同的方法修飾或結(jié)合到不同的分子上，從而具備了某些的功能與特定的細(xì)胞器或蛋白結(jié)合。通過(guò)化學(xué)修飾，單個(gè)熒光基團(tuán)可以產(chǎn)生許多變體形式，且每種變體都有不同的特異性。熒光抗體技術(shù)可以用于檢測(cè)和定位細(xì)胞或組織中的特定抗原物質(zhì)。公司免疫熒光檢查

免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞內(nèi)分子的相互作用。CD45免疫組化IHC

免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟：1.樣本準(zhǔn)備：細(xì)胞或薄組織。對(duì)單層生長(zhǎng)細(xì)胞，在傳代培養(yǎng)時(shí)，將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過(guò)的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞接近長(zhǎng)成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次；對(duì)懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞，用PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次，用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片。2.固定：取適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭颖?。一般?%PFA固定4℃過(guò)夜。固定完畢后的樣本可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個(gè)月。3.洗滌：PBS洗滌5min*3次。4.打孔：選擇合適的通透劑處理樣本，目的是使抗體更容易進(jìn)入細(xì)胞與抗原結(jié)合。CD45免疫組化IHC