免疫熒光實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng):為了保證熒光染色的正確性,初次試驗(yàn)時(shí)需設(shè)置下述對(duì)照,以排除某些非特異性熒光染色的干擾。①標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照:標(biāo)本加1-2滴0.01mol/L,pH7.4的PBS。②特異性對(duì)照(抑制試驗(yàn)):標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體,再加熒光標(biāo)記的特異性抗體。③陽(yáng)性對(duì)照:已知的陽(yáng)性標(biāo)本加熒光標(biāo)記的特異性抗體。如果標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照和特異性對(duì)照呈無(wú)熒光或弱熒光,陽(yáng)性對(duì)照和待檢標(biāo)本呈強(qiáng)熒光,則為特異性陽(yáng)性染色。一般標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過(guò)3min,就有熒光減弱現(xiàn)象,經(jīng)熒光染色的標(biāo)本較好在當(dāng)天觀察,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),熒光強(qiáng)度會(huì)逐漸下降。免疫熒光技術(shù)是一種以熒光素標(biāo)記抗體來(lái)定位抗原物質(zhì)的高度發(fā)達(dá)的標(biāo)記免疫技術(shù)。ki67免疫
免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng)。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性,所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時(shí),只要知道其中的一個(gè)因素,就可以查出另一個(gè)因素。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體(或抗原)上,與其相應(yīng)的抗原(或抗體)結(jié)合后,在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。在此基礎(chǔ)上又分為兩種方法:直接法和間接法。直接法:將標(biāo)記的特異性熒光抗體直接加到抗原上,經(jīng)過(guò)一定時(shí)間反應(yīng),即可結(jié)合并顯色。間接法:先用抗原的抗體(一抗)與抗原反應(yīng)結(jié)合,再用熒光標(biāo)記的二抗(一抗的抗體)與抗原反應(yīng),形成抗體-抗原-抗體復(fù)合物。CRT(Calreticulin)免疫熒光試驗(yàn)熒光抗體技術(shù)可以用于檢測(cè)和定位細(xì)胞或組織中的特定抗原物質(zhì)。
通過(guò)不同顏色熒光標(biāo)記不同的靶標(biāo),可以直觀的觀察同一樣品細(xì)胞內(nèi)不同結(jié)構(gòu)和蛋白。熒光標(biāo)記靶標(biāo)的方法主要包括熒光染料、免疫標(biāo)記、熒光融合蛋白等——這幾種方法均可選擇性標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)和蛋白,讓您在成像時(shí)更輕松地進(jìn)行觀察。細(xì)胞生物學(xué)采用的很多熒光工具基本上都是熒光基團(tuán)。這些熒光基團(tuán)經(jīng)過(guò)不同的方法修飾或結(jié)合到不同的分子上,從而具備了某些的功能與特定的細(xì)胞器或蛋白結(jié)合。通過(guò)化學(xué)修飾,單個(gè)熒光基團(tuán)可以產(chǎn)生許多變體形式,且每種變體都有不同的特異性。
熒光效率:熒光分子不會(huì)將全部吸收的光能都轉(zhuǎn)變成熒光,總或多或少地以其他形式釋放。熒光效率是指熒光分子將吸收的光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率,與發(fā)射熒光光量子的數(shù)值成正比。熒光效率=發(fā)射熒光的光量分子數(shù)(熒光強(qiáng)度)/吸收光的光量子數(shù)(激發(fā)光強(qiáng)度)。發(fā)射熒光的光量子數(shù)亦即熒光強(qiáng)度,除受激發(fā)光強(qiáng)度影響外,也與激發(fā)光的波長(zhǎng)有關(guān)。各個(gè)熒光分子有其特定的吸收光譜和發(fā)射光譜(熒光光譜),即在某一特定波長(zhǎng)處有較大吸收峰和較大發(fā)射峰。選擇激發(fā)光波長(zhǎng)量接近于熒光分子的較大吸收峰波長(zhǎng),且測(cè)定光波量接近于較大發(fā)射光波峰時(shí),得到的熒光強(qiáng)度也較大。免疫熒光技術(shù)是基于免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的重要方法之一。
免疫熒光技術(shù)的主要特點(diǎn)是:特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快。主要缺點(diǎn)是:非特異性染色問(wèn)題尚未完全解決,結(jié)果判定的客觀性不足,技術(shù)程序也還比較復(fù)雜。熒光免疫法按反應(yīng)體系及定量方法不同,還可進(jìn)一步分做若干種。與放射免疫法相比,熒光免疫法無(wú)放射性污染,并且大多操作簡(jiǎn)便,便于推廣。國(guó)外生產(chǎn)的TDM用試劑盒,有相當(dāng)一部分即屬于此類,并且還有TDM熒光偏振免疫分析用的自動(dòng)分析儀生產(chǎn)。由于一般熒光測(cè)定中的本底較高等問(wèn)題,熒光免疫技術(shù)用于定量測(cè)定有一定困難。新發(fā)展了幾種特殊的熒光免疫測(cè)定,與酶免疫測(cè)定和放射免疫分析一樣,在臨床檢驗(yàn)中應(yīng)用。免疫熒光技術(shù)可以用于研究神經(jīng)系統(tǒng)的功能和疾病。CTNT免疫檢測(cè)
在實(shí)際工作中,熒光抗原技術(shù)應(yīng)用較少,因此通常將其稱為熒光抗體技術(shù)或免疫熒光技術(shù)。ki67免疫
免疫熒光檢測(cè)相對(duì)于酶檢測(cè)的優(yōu)勢(shì):定量熒光信號(hào)的能力(與使用基于酶的方法進(jìn)行的定性測(cè)定相反);復(fù)用能力(可以結(jié)合不同發(fā)射光譜的熒光染料來(lái)檢測(cè)多種蛋白質(zhì));熒光染料的光穩(wěn)定性。免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理,先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素,制成熒光抗體,再用這種熒光抗體(或抗原)作為探針檢測(cè)組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)。在組織或細(xì)胞內(nèi)形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素,利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本,熒光素受外來(lái)激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光(黃綠色或橘紅色),可以看見(jiàn)熒光所在的組織細(xì)胞,從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位,以及利用定量技術(shù)測(cè)定含量。ki67免疫