組織免疫熒光染色

細胞免疫熒光主要用于蛋白定位研究和細胞內信號轉導，細胞免疫熒光技術是利用免疫技術和熒光標記技術相結合，原理就是利用抗原-抗體反應之后，采用熒光標記，標記完成后，顯微鏡下觀察細胞內某種抗原成分的多少，從而做出一個定位研究，也可以為細胞內信號傳導提供一個明確的指導，細胞免疫熒光具有敏感性強、特異性高、速度快的特點，是目前比較常用的組織學技術，也是比較精確的。免疫熒光染色的主要原理是利用抗原抗體之間的特異性結合來顯示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗結合，其次是帶有熒光基團的二抗識別并結合一抗，熒光顯微鏡下即可觀察到熒光。熒光抗體法是利用熒光標記的抗體來追蹤或檢查相應抗原的方法。組織免疫熒光染色

其他熒光物質：1．酶作用后產(chǎn)生熒光的物質某些化合物本身無熒光效應，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強熒光的物質。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發(fā)出熒光，激發(fā)光波長為360nm，發(fā)射光波長為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基乙酸等。2．鑭系螯合物某些3價稀土鑭系元素如銪（Eu3+）、鋱（Tb3+）、鈰（Ce3+）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光，其中以Eu3+應用較廣。Eu3+螯合物的激發(fā)光波長范圍寬，發(fā)射光波長范圍窄，熒光衰變時間長，較適合用于分辨熒光免疫測定。所需要的儀器：熒光顯微鏡、顯微熒光分光光度計、流式細胞儀和時間分辨熒光計等儀器激光共聚焦顯微鏡。CD31免疫組化免疫熒光技術可以用于研究病毒傳播和免疫應答。

細胞免疫熒光可以觀察蛋白在細胞中的定位，以及一些特殊信號分子蛋白的出核/入核的定位變化。在進行細胞免疫熒光過程中，需要用到細胞爬片，通過將爬片浸在細胞培養(yǎng)基內，細胞在爬片上生長，進而進行細胞的免疫熒光。實驗前準備：1.胰酶;2.DMEM細胞培養(yǎng)基;3.細胞培養(yǎng)12孔板或者6孔板;4.爬片。間接免疫熒光的優(yōu)點：通過增加能夠與一抗結合的二抗數(shù)量進行信號放大；與直接免疫熒光相比，通過信號放大提高檢測靈敏度。免疫熒光技術是一種以熒光素標記抗體來定位抗原物質的高度發(fā)達的標記免疫技術。

熒光的猝滅：熒光分子的輻射能力在受到激發(fā)光較長時間的照射后會減弱甚至猝滅，這是由于激發(fā)態(tài)分子的電子不能回復到基態(tài)，所吸收的能量無法以熒光的形式發(fā)射。一些化合物有天然的熒光猝滅作用而被用作猝滅劑，以消除不需用的熒光。因此熒光物質的保存應注意避免光（特別是紫外光）的直接照射和與其他化合物的接觸。在熒光抗體技術中常用一些非熒的色素物質如亞甲藍、堿性復紅。伊文思藍或低濃度的過錳酸鉀、碘溶液等對標本進行得當復染，以減弱非特異性熒光本質，使特異熒光更突出顯示。免疫熒光技術可以通過熒光顯微鏡觀察樣品中的熒光信號，從而確定目標分子的存在和位置。

免疫熒光技術的主要特點是：特異性強、敏感性高、速度快。主要缺點是：非特異性染色問題尚未完全解決，結果判定的客觀性不足，技術程序也還比較復雜。熒光免疫法按反應體系及定量方法不同，還可進一步分做若干種。與放射免疫法相比，熒光免疫法無放射性污染，并且大多操作簡便，便于推廣。國外生產(chǎn)的TDM用試劑盒，有相當一部分即屬于此類，并且還有TDM熒光偏振免疫分析用的自動分析儀生產(chǎn)。由于一般熒光測定中的本底較高等問題，熒光免疫技術用于定量測定有一定困難。新發(fā)展了幾種特殊的熒光免疫測定，與酶免疫測定和放射免疫分析一樣，在臨床檢驗中應用。使用熒光抗體方法是免疫熒光技術中常見的操作步驟。Glut2免疫熒光

免疫熒光技術可以用于研究細胞內分子的相互作用。組織免疫熒光染色

zo-1的免疫熒光，步驟如下：1.細胞在蓋片上生長融合到95%-100%時，從孵箱中取出。2.用預溫的1×PBS洗3次，每次10分鐘。3.4%的甲醛室溫固定20-30分鐘。4.1×PBS洗3次，每次10分鐘。5.0.2%TritonX-100透化2-5分鐘。6.1×PBS洗3次，每次10分鐘。7.5%BSA室溫封閉30分鐘。8.加一抗（用1%BSA稀釋）放在濕盒里，4度過夜。9.1×PBS洗3次，每次10分鐘。10.加二抗(用1%BSA稀釋)30分鐘，閉光。11.1×PBS洗3次，每次10分鐘。12.95%甘油封片。注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀釋。組織免疫熒光染色