高效液相色譜的歷史
1903年俄國植物化學(xué)家茨維特(Tswett)***提出“色譜法”(Chromatography)和“色譜圖”(Chromatogram)的概念。茨維特使用色譜法 chromatography 來描述他的彩色試驗(yàn)。
1930年以后,相繼出現(xiàn)了紙色譜、離子交換色譜和薄層色譜等液相色譜技術(shù)。
1952年,英國學(xué)者M(jìn)artin和Synge 基于他們在分配色譜方面的研究工作,提出了關(guān)于氣-液分配色譜的比較完整的理論和方法,把色譜技術(shù)向前推進(jìn)了一大步,這是氣相色譜在此后的十多年間發(fā)展十分迅速的原因。
1958年,基于Moore和Stein的工作,離子交換色譜的儀器化導(dǎo)致了氨基酸分析儀的出現(xiàn),這是近代液相色譜的一個(gè)重要嘗試,但分離效率尚不理想。
1960年中后期,氣相色譜理論和實(shí)踐發(fā)展,以及機(jī)械、光學(xué)、電子等技術(shù)上的進(jìn)步,液相色譜又開始活躍。到60年代末期把高壓泵和化學(xué)鍵合固定相用于液相色譜就出現(xiàn)了HPLC。
1970年中期以后,微處理機(jī)技術(shù)用于液相色譜,進(jìn)一步提高了儀器的自動(dòng)化水平和分析精度。
1990年以后,生物工程和生命科學(xué)在國際和國內(nèi)的迅速發(fā)展,為高效液相色譜技術(shù)提出了更多、更新的分離、純化、制備的課題,如人類基因組計(jì)劃,蛋白質(zhì)組學(xué)有HPLC作預(yù)分離等。
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什么是液相色譜?
液相色譜是一類分離與分析技術(shù),其特點(diǎn)是以液體作為流動(dòng)相,固定相可以有多種形式,如紙、薄板和填充床等。在色譜技術(shù)發(fā)展的過程中.為了區(qū)分各種方法,根據(jù)固定相的形式產(chǎn)生了各自的命名,如紙色譜、薄層色譜和柱液相色譜。
經(jīng)典液相色譜的流動(dòng)相是依靠重力緩慢地流過色譜柱,因此固定相的粒度不可能太小(100μm~150μm左右)。分離后的樣品是被分級收集后再進(jìn)行分析的,使得經(jīng)典液相色譜不僅分離效率低、分析速度慢,而且操作也比較復(fù)雜。直到20世紀(jì)60年代.發(fā)展出粒度小于10μm的高效固定相,并使用了高壓輸液泵和自動(dòng)記錄的檢測器,克服了經(jīng)典液相色譜的缺點(diǎn),發(fā)展成高效液相色譜,也稱為高壓液相色譜。
高效液相色譜綜述
HPLC的出現(xiàn)不過三十多年的時(shí)間,但這種分離分析技術(shù)的發(fā)展十分迅猛,應(yīng)用十分***。其儀器結(jié)構(gòu)和流程多種多樣。典型的高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)和流程可用下列方框圖表示(See Fig.3-4)。高效液相色譜儀一般都具備貯液器、高壓泵、梯度洗提裝置(用雙泵)、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器、恒溫器、記錄儀等主要部件。
高效液相色譜更適宜于分離、分析高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、有生理活性及相對分子量比較大的物質(zhì),因而廣泛應(yīng)用于核酸、肽類、內(nèi)酯、稠環(huán)芳烴、高聚物、藥物、人體代謝產(chǎn)物、表面活性劑,抗氧化劑、殺蟲劑、除銹劑的分析等物質(zhì)的分析。
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高效液相色譜相關(guān)術(shù)語
峰面積(peak area,A)—峰與峰底所包圍的面積。
保留時(shí)間(retention time,tR)——從進(jìn)樣開始到某個(gè)組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值的時(shí)間。
理論塔板數(shù)(theoretical plate number,N)——用于定量表示色譜柱的分離效率(簡稱柱效)。
分離度(resolution,R)——相鄰兩峰的保留時(shí)間之差與平均峰寬的比值。也叫分辨率,表示相鄰兩峰的分離程度。R≥1.5稱為完全分離。
《中國藥典》規(guī)定R應(yīng)大于1.5。
拖尾因子(tailing factor,T)——T=,用以衡量色譜峰的對稱性。也稱為對稱因子(symmetry factor)或不對稱因子(asymmetry factor)。
《中國藥典》規(guī)定T應(yīng)為0.95~1.05。
T1.05為拖尾峰。
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