聚合酶鏈式反應是一種體外迅速擴增DN段的技術，它能以極少量的DNA為模版，在幾小時內復制出上百萬份的DNA拷貝。DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動子的參與下，根據堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子挎貝。在實驗中發(fā)現，DNA在高溫時由于兩條鏈之間的氫鍵被破壞也可以發(fā)生變性解鏈，當溫度降低后又可以復形成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復性，并設計引物做啟動子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。但是，DNA聚合酶在高溫時會失活，因此，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶，不但操作煩瑣，而且價格...

聚合酶鏈反應：嵌套聚合酶鏈反應:通過減少DNA非特異性擴增的背景，提高DNA擴增的特異性。兩組引物用于兩個連續(xù)的PCR。在個反應中，一對引物用于產生DNA產物，除了預期的靶之外，該產物可能仍然由非特異性擴增的DN段組成。然后用一組引物將產物用于第二次聚合酶鏈反應，所述引物的結合位點完全或部分不同于次反應中使用的每個引物，并且位于其中的3’。嵌套式PCR在特異性擴增長DN段方面通常比傳統(tǒng)PCR更成功，但它需要更詳細的目標序列知識。重疊延伸聚合酶鏈反應或者通過重疊延伸拼接(SOEing):一種用于將兩個或多個含有互補序列的DN段拼接在一起的基因工程技術。它用于連接含有基因、調節(jié)序列或突變的DN段；...

聚合酶鏈反應的常見問題分析與解決方法：擴增產物出現多條帶(雜帶)：引物用量偏大，引物的特異性不高。應調換引物或降低引物的使用量。循環(huán)的次數過多。適當增加模板的量，減少循環(huán)次數。酶的用量偏高或酶的質量不好，應降低酶量或調換另一來源的酶。退火溫度偏低，退火及延伸時間偏長。應提高退火溫度，減少變性與延伸時間，也可采用二種溫度的PCR擴增。以2度為梯度設計梯度PCR反應優(yōu)化退火溫度。 樣品處理不當。Mg2+濃度偏高，因適當調整Mg2+使用濃度。若為PCR試劑盒，也可能時試劑盒本身質量有問題。復制提前終止。使用非熱啟動的聚合酶時常有發(fā)生。冰上準備反應體系或采用熱啟動聚合酶。流聚合酶鏈反應：一種偽等溫PC...

聚合酶鏈式反應：Taq(水生棲熱菌)聚合酶耐熱DNA聚合酶的很好活性溫度約為75-80°C(167-176°F),盡管該酶通常使用72°C(162°F)的溫度。在該步驟中，DNA聚合酶通過從反應混合物中添加在5’-至-3’方向上與模板互補的游離DNA鏈來合成與DNA模板鏈互補的新DNA鏈，在新生(伸長)DNA鏈的末端，將dNTPs的5'-磷酸基與3'-羥基縮合。延伸所需的精確時間取決于所使用的DNA聚合酶和要擴增的DNA目標區(qū)域的長度。根據經驗，在很好溫度下，大多數DNA聚合酶每分鐘聚合一千個堿基。在很好條件下(即，如果沒有限制底物或試劑的限制)，在每個延伸/延伸步驟中，DNA靶序列的數量加倍...