杭州細胞培養(yǎng)支原體檢測方法恒溫擴增

來源： 發(fā)布時間：2024-06-23

支原體污染和黑膠蟲污染是兩種不同類型的細胞培養(yǎng)污染，它們具有各自的特點和區(qū)別：
支原體污染：在相差顯微鏡下，支原體呈暗色微小顆粒位于細胞表面和細胞之間。
黑膠蟲污染：在高倍鏡下，被黑膠蟲污染的細胞膜會變得模糊不清，邊界不清晰，有粗糙感。

污染的影響：
支原體污染：可能導(dǎo)致細胞增殖緩慢，甚至從培養(yǎng)器皿脫落，影響細胞的DNA、RNA及蛋白表達。
黑膠蟲污染：與細胞競爭性生長，開始時對細胞沒有什么影響，但當(dāng)數(shù)量多時，細胞生長會受到影響直至死亡。

污染的來源：
支原體污染：可能來源于工作環(huán)境的污染、操作者本身、培養(yǎng)基的污染、交叉污染、實驗器材帶來的污染以及用來制備細胞的原始組織或部位的污染。
黑膠蟲污染：可能來源于細胞本身的污染或從動物取材時的污染，也可能通過培養(yǎng)箱空氣進行污染。
細胞培養(yǎng)過程中支原體污染怎么預(yù)防？杭州細胞培養(yǎng)支原體檢測方法恒溫擴增

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支原體檢測實驗方法需要考慮以下幾個關(guān)鍵點：
1. 樣本的采集與處理：確保樣本的采集和處理過程符合無菌操作規(guī)范，避免交叉污染。
2. 實驗操作的標準化：制定詳細的實驗操作流程，包括樣本接種、培養(yǎng)條件、觀察時間點等，以保證實驗的可重復(fù)性和準確性。
3. 使用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基：根據(jù)支原體的特性選擇合適的培養(yǎng)基，如支原體肉湯4. 培養(yǎng)基、精氨酸支原體肉湯培養(yǎng)基等，并確保培養(yǎng)基的靈敏度和特異性。
5. 設(shè)置對照組：實驗中應(yīng)包括陽性對照和陰性對照，以驗證實驗方法的有效性和排除假陽性或假陰性結(jié)果。
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LAMP法，即環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification），是一種在恒定溫度下進行的核酸擴增方法。它由日本學(xué)者Notomi于2000年開發(fā)。LAMP法檢測有以下特性：
快速高效：LAMP技術(shù)可以在1小時內(nèi)把幾拷貝的目的序列迅速擴增到10^9^～10^10^拷貝，擴增效率高。
簡便性：LAMP技術(shù)不需要進行模板的預(yù)變性，減少了PCR技術(shù)升降溫帶來的影響以及對昂貴、精密實驗儀器的要求，同時擴增效率高，可以在較短時間內(nèi)完成檢測。
LAMP法因其快速、高效、特異、靈敏和經(jīng)濟等優(yōu)點，已經(jīng)應(yīng)用于病原菌、寄生蟲、病毒、疾病和轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測等領(lǐng)域，并且還將廣泛應(yīng)用于臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測、食源安全等領(lǐng)域，具有更為廣闊的發(fā)展應(yīng)用前景。

細胞培養(yǎng)中支原體難以徹底消滅的原因主要包括以下幾點：
1. 無細胞壁結(jié)構(gòu)：支原體是沒有細胞壁的微生物，這使得許多作用于細胞壁的抗*素對支原體無效。
2. 微小體積：支原體體積小，能夠穿過常規(guī)的除菌濾膜，例如0.20微米甚至0.10微米的濾膜。
3. 隱匿性：支原體污染初期很難被察覺，它們在普通光學(xué)顯微鏡下幾乎不可見，因此細胞被支原體污染后，前期很難被發(fā)現(xiàn)。
4. 傳播途徑多樣：支原體可以通過細胞培養(yǎng)物、細胞懸液、細胞培養(yǎng)用具等途徑迅速傳播。
5. 污染源 ：支原體污染源包括細胞間的交叉污染、操作人員的口腔、皮膚，以及細胞培養(yǎng)用的組分如血清、培養(yǎng)液等。
6. 環(huán)境因素：實驗室環(huán)境、試驗臺、超凈臺、培養(yǎng)箱等可能被支原體污染，引起細胞的污染。
7. 抗*素耐藥性：支原體可能對某些抗*素產(chǎn)生耐藥性，使得治*效果變差。
8. 檢測和清理方法的局限性：一些傳統(tǒng)的支原體檢測和清理方法可能不夠靈敏或有效，導(dǎo)致難以徹底清理支原體
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支原體去除的原理通常涉及以下幾個方面：
1. 抗*素作用：使用特定的抗*素制劑來抑制支原體的生長和繁殖。例如，含有喹諾酮類、四環(huán)素衍生物類和大環(huán)內(nèi)酯類抗*素的混合制劑，這些抗*素能夠抑制支原體的DNA和蛋白合成。
2. 破壞細胞膜：支原體去除劑中的抑菌肽（AMPs）成分通過破壞支原體細胞膜的完整性，導(dǎo)致支原體細胞死亡。
3. 抑制DNA復(fù)制：支原體去除劑通過抑制支原體DNA回旋酶活性，有效抑制支原體DNA的復(fù)制，從遺傳物質(zhì)著手徹底殺滅支原體。
4. 協(xié)同作用：某些支原體去除劑利用抑菌肽（AMPs）和穿膜肽（CPPs）的協(xié)同作用來除去支原體，穿膜肽能夠幫助抑菌肽更有效地穿透細胞膜，增強其殺滅支原體的能力。

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支原體及污染方式有哪些？杭州細胞培養(yǎng)支原體檢測方法恒溫擴增

支原體去除試劑使用后，對支原體的檢測可能會有影響。一些支原體去除試劑通過特異性地與支原體膜結(jié)合、改變支原體膜的通透性來殺死支原體，而對真核細胞幾乎沒有影響。然而，某些情況下，去除試劑可能會對細胞的活力和形態(tài)產(chǎn)生一定的影響，尤其是在去除劑作用期間。此外，如果去除劑的效果不徹底，可能會導(dǎo)致細胞再次被支原體污染。

需要注意的是，某些支原體去除試劑可能會在去除支原體的過程中導(dǎo)致支原體膜溶解，從而釋放出支原體的DNA，這可能會在隨后的支原體核酸檢測中引起假陽性結(jié)果。因此，在去除支原體后，建議在繼續(xù)正常傳代培養(yǎng)幾代細胞后再進行支原體檢測，以確保檢測結(jié)果的準確性。
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