鼠尾膠原、多聚賴氨酸和明膠3種基質(zhì)對角膜上皮細胞增殖的影響:目的探討鼠尾膠原、多聚賴氨酸和明膠3種基質(zhì)對體外培養(yǎng)角膜上皮細胞增殖的影響。方法采用鼠尾膠原、多聚賴氨酸和明膠作為基質(zhì)包被培養(yǎng)器皿,以普通培養(yǎng)器皿作對照,培養(yǎng)角膜上皮細胞,觀察細胞形態(tài),進行細胞計數(shù)并描繪細胞生長曲線,比較不同基質(zhì)對角膜上皮細胞的增殖作用。結(jié)果使用基質(zhì)包被的培養(yǎng)器皿培養(yǎng)角膜上皮細胞,細胞增殖速度較普通組快,細胞形態(tài)、活力和長勢比普通組更佳,促進增殖的能力為鼠尾膠原多聚賴氨酸明膠。結(jié)論鼠尾膠原可促進角膜上皮細胞增殖,且增殖效果優(yōu)于多聚賴氨酸和明膠。論鼠尾膠原能促進毛細胞貼壁,涂布鼠尾膠原有利于膜片鉗實驗的長時程記錄,并且制作簡便,成本低廉。鼠尾Ⅰ型膠原:選擇適當(dāng)?shù)墓切迯?fù)材料是治好骨缺損的中心環(huán)節(jié)。寧波正規(guī)鼠尾膠原廠家供應(yīng)
I型鼠尾膠原是借鑒NavneetaRajan,JasonHabermehl法,經(jīng)過乙酸抽提、離心、滅菌、透析等步驟制備得到的高純度、高活性膠原蛋白,屬于醫(yī)藥級別產(chǎn)品,可用于包被細胞培養(yǎng)器皿(單分子層包被),適合多種類型細胞的貼壁如肝臟細胞、神經(jīng)節(jié)細胞、胚胎細胞、肌細胞、肺細胞、神經(jīng)鞘細胞等。I型膠原蛋白包被細胞培養(yǎng)板,規(guī)格為6/24孔板,表面經(jīng)I型膠原蛋白包被,可以很好的降低蛋白質(zhì)的吸附。使用這種細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)細胞,可以獲得良好的細胞貼壁率,細胞增殖速度快,形態(tài)均一,細胞培養(yǎng)成功率高。濟南鼠尾膠原直銷廠家探討應(yīng)用鼠尾膠原在豚鼠前庭毛細胞膜片鉗實驗中的促進毛細胞貼壁效果。
鼠尾膠原膠凝程序:膠原蛋白I按以下步驟使其pH達到堿性時凝膠。1)將無菌5cm左右的紗布海綿貼在150mm培養(yǎng)皿的蓋子上來制備氨蒸氣室。用氫氧化銨使紗布飽和,把蓋子放在150mm的培養(yǎng)皿上,暫放置一邊。2)將膠原蛋白I均勻涂布在要包被物的表面上,厚度可以根據(jù)需要改變,膠原蛋白I(50-100μL)足以涂覆22mm的蓋玻片。對于直徑100mm的培養(yǎng)皿,每個加入約6mL;對于60mm培養(yǎng)皿添加約2.3mL,對于35mm培養(yǎng)皿添加約1mL。3)將涂有膠原蛋白的蓋玻片或帶有蓋子的培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移到氨蒸氣室并暴露三分鐘。4)在無菌蒸餾水中(35mm培養(yǎng)皿加5mL,60mm培養(yǎng)皿加10mL等)浸泡涂布的蓋玻片或培養(yǎng)皿30min。吸取原蒸餾水并加0.5-1.0mL無菌蒸餾水,放置在層流罩中過夜。5)吸出蒸餾水,用含血清的平衡鹽緩沖液溶液代替并保存在2-8°C。
鼠尾膠原蛋白Ⅰ型使用方法及注意事項:三維膠原的制備鼠尾膠原蛋白型在濃度1mg/ml以上,pH左右時可形成具有一定強度三維膠,建議成膠濃度1-2mg/ml。膠原蛋白溶解于0.006mol/L乙酸中,在成膠過程中需要加入0.06體積的0.1mol/LNaOH來中和。需要的溶液(均需要無菌、預(yù)冷)10mg/L酚紅用于pH指示)0.1mol/LNaOH,0.1mol/L乙酸(一般不用),雙蒸水200ul鼠尾膠原蛋白型(5mg/ml)加到置于冰浴的離心管中,加入690ulH2O12ul0.1mol/LNaOH12ul0.1mol/LNaOH加到膠原溶液中,會由于NaOH不能迅速混勻而產(chǎn)生局部的膠原凝結(jié))立即混勻。再加入100ul10PBS10培養(yǎng)液,混勻后立即加到培養(yǎng)器皿中(混勻后pH左右,如果PBS或培養(yǎng)液中沒有加酚紅,初次使用時需要用pH試紙測試)。論鼠尾膠原能促進毛細胞貼壁,涂布鼠尾膠原有利于膜片鉗實驗的長時程記錄,并且制作簡便,成本低廉。利用鼠尾膠原將小玻片固定于培養(yǎng)瓶內(nèi)。
膠原蛋白的提取方法:酶法提?。好阜ㄌ崛∈抢玫鞍酌甘鼓z原溶解,水解條件溫和,反應(yīng)速率快,提取的膠原蛋白仍有完整的三股螺旋結(jié)構(gòu),蛋白純度高,理化性質(zhì)穩(wěn)定,且無環(huán)境污染。酶法提取常用的蛋白酶有:胃蛋白酶、胰蛋白酶或者復(fù)合酶。工藝可選擇一步法,即利用酶液直接提??;二步法,即先用酸或者堿進行初步提取,然后再用酶提取。Langmaier等[6]用MgO預(yù)處理革屑,然后用堿性蛋白酶提取膠原的水解產(chǎn)物。CabezaL.F.T等[7]先用胃蛋白酶,再用堿性蛋白酶提取了2種不同的膠原水解產(chǎn)物。趙蒼碧等[2]采用胃蛋白酶和無花果蛋白酶消化法從牛腱中提取膠原蛋白,探討了酶和酶的加入量對提取結(jié)果的影響,給出了酶對膠原提取較佳工藝配比,酶與牛腱的質(zhì)量比為0.1時效果較佳,而使用無花果蛋白酶時,0.01的配比較佳。開蓋在超凈臺上過夜晾干,也可以在室溫放置1小時后。溫州正規(guī)鼠尾膠原廠家直銷
鼠尾I型膠原蛋白系采用方法在無菌下制備,純度達到95%以上。寧波正規(guī)鼠尾膠原廠家供應(yīng)
鼠尾膠原蛋白Ⅰ型使用方法及注意事項:將培養(yǎng)器皿在室溫(25度左右)下放置20分鐘待膠凝固后,轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱內(nèi)。如果配制中使用的是10PBS,使用前需要加入適當(dāng)體積的細胞培養(yǎng)液預(yù)平衡。B.含細胞的三維膠原的制備(以配制200ul鼠尾膠原蛋白(5mg/ml)加到(如果反過來把12ul0.1mol/LNaOH加到膠原溶液中,會由于NaOH不能迅速混勻而產(chǎn)生局部的膠原凝結(jié)),立即混勻。再加入23ul10PBS10培養(yǎng)液,混勻(混勻后pH左右,如果PBS或培養(yǎng)液中沒有加酚紅,初次使用時需要用pH試紙測試)。加入760ul的細胞懸浮液,混勻后立即加到培養(yǎng)器皿中。將培養(yǎng)器皿在室溫下放20分鐘待膠凝固后,加入適當(dāng)體積的細胞培養(yǎng)液,轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。注意事項型在室溫下pH中性時可迅速成膠,在操作過程中要盡量保持低溫。鼠尾肌腱膠原蛋白I(rattailtendoncollagentypeI)根據(jù)Birkedal-Hansen方法,經(jīng)過醋酸(HAc)抽提、氯化鈉沉淀、磷酸氫二鈉沉淀等步驟制備所得。寧波正規(guī)鼠尾膠原廠家供應(yīng)
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