進口ultima2PPLUS雙光子顯微鏡的成像視野

雙光子顯微鏡為什么穿透能力強？因為組織對可見光區(qū)域的較強吸收和散射帶來兩個嚴重的問題第1個是激發(fā)光的減弱，第2個就是另外就是由于物鏡本身光的光學(xué)特性，單光子激發(fā)的背景較強，所以才有共聚焦系統(tǒng)提高成像的分辨率因為組織對可見光區(qū)域的較強吸收和散射帶來兩個嚴重的問題第1個是激發(fā)光的減弱，第2個就是另外就是由于物鏡本身光的光學(xué)特性，單光子激發(fā)的背景較強，所以才有共聚焦系統(tǒng)提高成像的分辨率剛好雙光子在這兩點具有很大的優(yōu)勢上面的內(nèi)容基本在談到雙光子優(yōu)勢都會相對說明，在實際操作中成像的深度和樣品的關(guān)系很大，雙光子成像利用高亮度的熒光標記材料，已經(jīng)有做到mm級別的穿透深度雙光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為光源；進口ultima2PPLUS雙光子顯微鏡的成像視野

雙光子顯微鏡的優(yōu)勢相比普通的顯微鏡電子顯微鏡可以觀察尺度更小的東西，冷凍電鏡更是可以觀察有活性的生物大分子，而雙光子顯微鏡有什么優(yōu)勢呢？它能做到什么普通光學(xué)顯微鏡做不到的事情嗎？原來，雙光子顯微鏡可以精確穿透較厚標本進行定點、觀察！由于電磁波的波長越短，粒子性越強，受散射影響也就越大。雙光子顯微鏡將激發(fā)光源改為長波長激光，在增加了激光的穿透性的同時還減少了對細胞的毒性。除此之外，因為只有物鏡焦點處能發(fā)生雙光子激發(fā)效應(yīng)，所以掃描的精確度極高，也能提高激發(fā)光效率，減少被掃描點之外的熒光物質(zhì)消耗。國內(nèi)熒光雙光子顯微鏡廠家電話成像平臺倒置雙光子顯微鏡啟用顯微鏡自帶調(diào)焦設(shè)備。

在傳統(tǒng)寬場顯微鏡中，來自標本不同縱深的光線都可投射到同一焦平面（感光元件）上，所以其成像是整個樣品的重疊像，沒有縱向分辨能力。單光子激光共聚焦顯微鏡用***有效濾除了雜散光，分辨率有了本質(zhì)上的提高，擁有了對樣品的特定焦平面精細成像的能力，可以進行三維成像、動態(tài)成像等。然而，***在濾除雜散光的同時也將大部分來自焦平面的熒光濾除了，只有很弱的熒光到達檢測器。若要提高信號強度，需要加大激發(fā)光功率，這又會導(dǎo)致對活細胞的光毒性和熒光分子的光漂白增加。雙光子顯微鏡比較大的優(yōu)勢來源于其雙光子光源的非線性光學(xué)效應(yīng)，與單光子共聚焦顯微鏡比較大的不同在于無須使用***限制光學(xué)散射，其具體優(yōu)勢如下。

共聚焦顯微可以呈現(xiàn)這么漂亮的圖像，是不是什么樣品都可以用共聚焦顯微鏡拍拍拍.....得到各種各樣清晰漂亮的圖像呢？答案是否定的，任何事物都有優(yōu)缺點，何況一臺儀器呢，共聚焦顯微鏡也是有自己的局限,共聚焦有哪些局限呢：1.共聚焦顯微鏡只能拍攝約200um以內(nèi)的的樣品，對于厚的或者樣品不能進拍攝；2. 共聚焦顯微鏡由于是逐點進行掃描，對樣品的光毒性還是比較大的，特別是拍攝活細胞樣品時就更容易對樣品進行淬滅；3. 由于光照射的區(qū)域幾乎能通過這個Z軸的層面，所以對于空間定點光刺激的實驗定點位置就不是特別精確；并且激光共聚焦顯微鏡沒有純紫外進行激發(fā)，對于一些特殊激發(fā)波長的實驗，效率非常低。雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收 2 個長波長的光子，在經(jīng)過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后，發(fā)射出一個波長較短的光子；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，為了不損傷細胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖寬度只有 100 飛秒，而其周期可以達到 80至100兆赫茲。雙光子顯微鏡有哪些分類呢？

從雙光子的原理和特點我們就可以明顯的得出雙光子的優(yōu)點：☆光損傷?。河捎陔p光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為激發(fā)光源，這一波段的光對***細胞和組織的光損傷小，適用于長時間的研究；☆穿透能力強：相對于紫外光，可見光和近紅外光都具有更強的穿透能力，因而受生物組織散射的影響更小，解決對生物組織中深層物質(zhì)的層析成像研究問題；☆高分辨率：由于雙光子吸收截面很小，只有在焦平面很小的區(qū)域內(nèi)可以激發(fā)出熒光，雙光子吸收只局限于焦點處的體積約為波長3次方的范圍內(nèi)；☆漂白區(qū)域?。河捎诩ぐl(fā)只存在于交點處，所以焦點以外的區(qū)域都不會發(fā)生光漂白現(xiàn)象；☆熒光收集率高：與共聚焦成像相比，雙光子成像不需要光學(xué)濾波器（共焦***），這樣就提高了對熒光的收集率，而收集率的提高直接導(dǎo)致圖像對比度的提高；☆圖像對比度高：由于熒光波長小于入射波長，因而瑞利散射產(chǎn)生的背景噪聲只有單光子激發(fā)時的1/16，較大降低了散射的干擾；☆光子躍遷具有很強的選擇激發(fā)性，所以可以對生物組織中一些特殊物質(zhì)進行成像研究；顯微成像技術(shù)包含：雙光子顯微鏡、寬場熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡、全內(nèi)反射熒光顯微鏡等多種成像方式。布魯克雙光子顯微鏡光子躍遷

雙光子顯微鏡大量運營在實驗室當中；進口ultima2PPLUS雙光子顯微鏡的成像視野

雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎得主MariaGoeppertMayer提出，30年后因為有了激光才得到實驗驗證，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用，首先要了解其中的非線性過程。雙光子吸收相當于和頻產(chǎn)生非線性過程，這要求極高的電場強度，而電場取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小，脈寬越窄，雙光子吸收效率越高。對于衍射極限顯微鏡，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長有關(guān)，所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬。基于以上分析，能夠以高重頻(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標準激發(fā)光源。這也再次說明雙光子顯微鏡的優(yōu)勢：只有焦平面處才能形成雙光子吸收，而焦平面之外由于光強低無法被激發(fā)，所以雙光子成像更清晰。WinfriedDenk初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬、630nm可見光波長)。雖然染料激光器對于實驗室演示尚可，但是使用很不方便所以遠未實現(xiàn)商用。很快雙光子顯微鏡的標配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態(tài)光源優(yōu)勢，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調(diào)諧范圍，而近紅外相比可見光穿透更深，對生物樣品損傷更小。進口ultima2PPLUS雙光子顯微鏡的成像視野