進口多光子顯微鏡多光子激發(fā)

    基于多光子顯微鏡的神經(jīng)成像技術(shù)原理：多光子顯微鏡可用于深度成像和三維成像，因此可用于拍攝不透明的厚樣品。目前主要使用的多光子顯微鏡包括雙光子顯微鏡和三光子顯微鏡。雙光子顯微鏡的結(jié)構(gòu)與共焦類似，區(qū)別在于：1)雙光子顯微鏡的激發(fā)光波長比共焦長，能量較低，但穿透能力較強；2)雙光子顯微鏡沒有小孔，提高了檢測效率；3)雙光子顯微鏡成像深度較快提高。那么，為什么雙光子能具有共焦顯微鏡所沒有的優(yōu)勢呢？原因是它采用雙光子激發(fā)方式。使用波長較長的激發(fā)光子，光子的能量較低，因此電子需要吸收兩個這樣的激發(fā)光子才能達到激發(fā)態(tài)，從而釋放出一個熒光光子。因此，熒光信號的強度與光強的平方成正比。因為焦點處的光強較大，只能在焦點處激發(fā)熒光。波長越長，穿透力越強，因此雙光子顯微鏡的成像深度大于共焦顯微鏡。由于兩個光子只在焦點激發(fā)熒光，不需要小孔，而是將所有的熒光都收集起來，提高了檢測效率。三光子顯微鏡的原理類似于雙光子顯微鏡，利用三個激發(fā)光子可以實現(xiàn)更深的成像深度。由于使用了更長的激發(fā)波長，穿透能力更強，成像深度更大。此外，由于較強的非線性效應(yīng)，熒光信號的強度與光強的立方成正比，因此比雙光子具有更低的非聚焦激發(fā)和背景噪聲。 多光子顯微鏡的分辨率比傳統(tǒng)的單光子共聚焦要低的多。進口多光子顯微鏡多光子激發(fā)

當激光光束焦點的位置在鏡面上，此時被反射的激光在無限空間中成為準直光束，并在OBJ2的焦平面上形成了一個激光光斑。同理，如果橫向掃描光束，則會形成遠離傾斜鏡鏡面的焦點，這又導(dǎo)致返回的光束會聚或發(fā)散，進而OBJ2能在軸向不同位置形成焦點，通過這種方式即能實現(xiàn)連續(xù)的軸向掃描。對于較小的傾斜角，聚焦沒有球差。該組在實驗中表征了這種將橫向掃描轉(zhuǎn)換為軸向掃描技術(shù)的光學(xué)性能，并使用它將光片顯微鏡的成像速度提升了一個數(shù)量級，從而可以在三個維度上量化快速的囊泡動力學(xué)。該組還演示了使用雙光子光柵掃描顯微鏡以12 kHz進行共振遠程聚焦，該技術(shù)可對大腦組織和斑馬魚心臟動力學(xué)進行快速成像，并具有衍射極限的分辨率。 清醒動物多光子顯微鏡成像深度多光子顯微鏡中，極短的激光脈沖聚焦在樣品上的緊密點上，激發(fā)熒光團產(chǎn)生圖像。

多光子激發(fā)的特點。激發(fā)波長∶兩個或多個光子同時激發(fā)，激發(fā)波長是單光子激發(fā)波長的兩倍或多倍（i.e.紅光能激發(fā)UV探針）。多光子激發(fā)∶依賴于多個光子同時到達的時間。使用脈沖飛秒激光器（i.e.10-16 seconds），且能提供更高的峰值功率。熒光限制在焦點處，能滿足多個光子同時達到產(chǎn)生多光子吸收。熒光強度正比于（激光強度）n。為什么使用飛秒激光器?多光子激發(fā)需要超快的激光器，皮秒脈沖不能實現(xiàn)三光子激發(fā)。深度成像需要更高、更窄脈沖輸出功率。多光子激發(fā)光源處于近紅外區(qū)，對細胞毒性和光漂白更小。

比較兩表格中的相關(guān)參數(shù)可以看出，基于分子光學(xué)標記的成像技術(shù)已經(jīng)在生物活檢和基因表達規(guī)律方面展示了較大的優(yōu)勢。例如，正電子發(fā)射斷層成像（PET）可實現(xiàn)對分子代謝的成像，空間分辨率∶1-2mm，時間分辨率;分鐘量級。與PET比較，光學(xué)成像的應(yīng)用場合更廣（可測量更多的參數(shù)，請參見表1-1），且具有更高的時間分辨率（秒級），空間分辨率可達到微米。因此，二者相比，雖然光學(xué)成像在測量深度方面不及PET，但在測量參數(shù)種類與時空分辨率方面有一定優(yōu)勢。對于小動物（如小白鼠）研究來說，光學(xué)成像技術(shù)可以實現(xiàn)小動物整體成像和在體基因表達成像。例如，初步研究表明，熒光介導(dǎo)層析成像可達到近10cm的測量深度;基于多光子激發(fā)的顯微成像技術(shù)可望實現(xiàn)小鼠體內(nèi)基因表達的實時在體成像。多光子顯微鏡技術(shù)的優(yōu)勢如何？又有哪些應(yīng)用？

快速光柵掃描有多種實現(xiàn)方式，使用振鏡進行快速2D掃描，將振鏡和可調(diào)電動透鏡結(jié)合在一起進行快速3D掃描，但可調(diào)電動透鏡由于機械慣性的限制在軸向無法快速進行焦點切換，影響成像速度，現(xiàn)可使用空間光調(diào)制器（SLM）代替。遠程聚焦也是一種實現(xiàn)3D成像的手段，如圖2所示。在LSU模塊中，掃描振鏡進行橫向掃描，ASU模塊包括物鏡L1和反射鏡M，通過調(diào)控M的位置實現(xiàn)軸向掃描。該技術(shù)不僅可以校正主物鏡L2引入的光學(xué)像差，還可以進行快速的軸向掃描。想要獲得更多神經(jīng)元成像，可以通過調(diào)整顯微鏡的物鏡設(shè)計來擴大FOV，但是具有大NA和大FOV的物鏡通常重量較大，無法快速移動以進行快速軸向掃描，因此大型FOV系統(tǒng)依賴于遠程聚焦、SLM和可調(diào)電動透鏡。多光子顯微鏡的大多數(shù)補償器都采用棱鏡。全自動多光子顯微鏡實驗

4tune光譜檢測器，實現(xiàn)多光子顯微鏡的光譜型檢測。進口多光子顯微鏡多光子激發(fā)

細胞在受到外界刺激時，隨著刺激時間的增長，即使刺激繼續(xù)存在，Ca2+熒光信號不但不會繼續(xù)增強，反而會減弱，直至恢復(fù)到未加刺激物時的水平。對于細胞受精過程中 Ca2+熒光信號的變化情況，研究發(fā)現(xiàn)，配了在粘著過程中，Ca2+熒光信號未發(fā)生任何變化，而配子之間發(fā)生融合作用時，Ca2+熒光信號強度卻會出現(xiàn)一個不穩(wěn)定的峰值，并可持續(xù)幾分鐘。這些現(xiàn)象，對研究受精發(fā)育的早期信號及 Ca2+在卵細胞和受精卵的發(fā)育過程中的作用具有重要的意義。在其它一些生理過程如細胞分裂、胞吐作用等，Ca2+熒光信號強度也會發(fā)生很的變化。進口多光子顯微鏡多光子激發(fā)