模塊化多光子顯微鏡實驗操作

現(xiàn)代分子生物學技術(shù)的迅速發(fā)展和科技的進步，特別是隨著后基因組時代的到來，人們已經(jīng)能夠根據(jù)需要建立各種細胞模型，為在體研究基因表達規(guī)律、分子間的相互作用、細胞的增殖、細胞信號轉(zhuǎn)導、誘導分化、細胞凋亡以及新的血管生成等提供了良好的生物學條件。然而，盡管人們利用現(xiàn)有的分子生物學方法，已經(jīng)對基因表達和蛋白質(zhì)之間的相互作用進行了深入、細致的研究，但仍然不能實現(xiàn)對蛋白質(zhì)和基因活動的實時、動態(tài)監(jiān)測。在細胞的生理過程中，基因、尤其是蛋白質(zhì)的表達、修飾和相萬作用往往發(fā)生可逆的、動態(tài)的變化。目前的分子生物學方法還不能捕獲到蛋白質(zhì)和基因的這些變化，但獲取這些信息對與研究基因的表達和蛋白質(zhì)之間的相互作用又至關(guān)重要。因此，發(fā)展能用于、動態(tài)、實時、連續(xù)監(jiān)測蛋白質(zhì)和基因活動的方法是非常必要的。雙光子共聚焦顯微鏡比單光子共聚焦顯微鏡具有更亮的橫向分辨率和縱向分辨率。模塊化多光子顯微鏡實驗操作

多光子激光掃描顯微鏡行業(yè)發(fā)展，世界多光子激光掃描顯微鏡產(chǎn)業(yè)主要布局在德國和日本，德國是以徠卡顯微系統(tǒng)和蔡司為，而日本以尼康和奧林巴斯公司為，2020年，上述企業(yè)占據(jù)著世界多光子激光掃描顯微鏡市場64.44%的市場份額，其發(fā)展戰(zhàn)略左右著多光子激光掃描顯微鏡市場的走向。目前世界市場對多光子激光掃描顯微鏡的需求在增長，中國市場這方面的需求增長更快，未來五年多光子激光掃描顯微鏡市場的發(fā)展在中國將具有很大的發(fā)展?jié)摿ΑＣ绹鵁晒舛喙庾语@微鏡供應(yīng)商目前主要使用的多光子顯微鏡包括雙光子顯微鏡和三光子顯微鏡。

使用MPM對神經(jīng)元進行成像時，通過隨機訪問掃描—即激光束在整個視場上的任意選定點上進行快速掃描—可以只掃描感興趣的神經(jīng)元，這樣不僅避免掃描到任何未標記的神經(jīng)纖維，還可以優(yōu)化激光束的掃描時間。隨機訪問掃描可以通過聲光偏轉(zhuǎn)器（AOD）來實現(xiàn)，其原理是將具有一個射頻信號的壓電傳感器粘在合適的晶體上，所產(chǎn)生的聲波引起周期性的折射率光柵，激光束通過光柵時發(fā)生衍射。通過射頻電信號調(diào)控聲波的強度和頻率從而可以改變衍射光的強度和方向，這樣使用1個AOD就可以實現(xiàn)一維橫向的任意點掃描，利用1對AOD，結(jié)合其他軸向掃描技術(shù)可實現(xiàn)3D的隨機訪問掃描。但是該技術(shù)對樣本的運動很敏感，易出現(xiàn)運動偽影。目前，快速光柵掃描即在FOV中進行逐行掃描，由于利用算法可以輕松解決運動偽影而被普遍的使用。

根據(jù)阿貝成像原理，許多光學成像系統(tǒng)是一個低通濾波器，物平面包含從低頻到高頻的信息，透鏡口徑會限制高頻信息通過，只允許一定的低頻通過，因此丟失了高頻信息會使成像所得圖像的細節(jié)變模糊，降低分辨率。對于三維成像來說，寬場照明時得到的信息不僅包含物鏡焦平面上樣品的部分信息，同時還包含焦平面外的樣品信息。由于受到焦平面外的信息干擾，常規(guī)熒光顯微鏡無法獲得層析圖像。三維結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡能夠提高分辨率、獲得層析圖像，是因為利用特定結(jié)構(gòu)的照明光能引入樣品的高頻信息，當結(jié)構(gòu)光的空間頻率足夠高時，只有靠近焦面的部分才能被結(jié)構(gòu)光調(diào)制，超出這一區(qū)域，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榫鶆蛘彰鳎簿褪侵挥薪姑娓浇挠邢迏^(qū)域具有相對完整的頻譜信息，離焦后，高頻信息迅速衰減，所以使用高頻結(jié)構(gòu)光照明可以區(qū)分焦面和離焦區(qū)域來獲得層析圖像。然后再通過軸向掃描可以獲取樣品不同深度的焦面圖像，重建樣品的三維結(jié)構(gòu)。融合光譜技術(shù)，多光子顯微鏡實現(xiàn)更豐富的生物組織信息獲取。

有許多方法可以實現(xiàn)快速光柵掃描，例如使用振鏡進行快速2D掃描，以及將振鏡與可調(diào)電動透鏡相結(jié)合進行快速3D掃描。而可調(diào)電動式鏡頭由于機械慣性的限制，無法在軸向快速切換焦點，影響成像速度?，F(xiàn)在它可以被空間光調(diào)制器(SLM)取代。遠程對焦也是實現(xiàn)3D成像的一種手段，如圖2所示。LSU模塊中，掃描振鏡水平掃描，ASU模塊包括物鏡L1和反射鏡M，通過調(diào)整M的位置實現(xiàn)軸向掃描該技術(shù)不僅可以校正主物鏡L2引入的光學像差，還可以進行快速軸向掃描。為了獲得更多的神經(jīng)元成像，可以通過調(diào)整顯微鏡的物鏡設(shè)計來放大FOV。然而，大NA和大FOV的物鏡通常很重，不能快速移動以進行快速軸向掃描，因此大FOV系統(tǒng)依賴于遠程聚焦、SLM和可調(diào)電動透鏡。多光子顯微鏡是一種強大的顯微鏡技術(shù)，具有廣泛的應(yīng)用前景和發(fā)展?jié)摿?。美國清醒動物多光子顯微鏡能量脈沖

顯微鏡簡史：從光到多光子顯微鏡。模塊化多光子顯微鏡實驗操作

對于雙光子成像而言，離焦和近表面熒光激發(fā)是兩個比較大的深度限制因素，而對于三光子成像這兩個問題大大減小，但是三光子成像由于熒光團的吸收截面比2P要小得多，所以需要更高數(shù)量級的脈沖能量才能獲得與2P激發(fā)的相同強度的熒光信號。功能性3P顯微鏡比結(jié)構(gòu)性3P顯微鏡的要求更高，它需要更快速的掃描，以便及時采樣神經(jīng)元活動；需要更高的脈沖能量，以便在每個像素停留時間內(nèi)收集足夠的信號。復雜的行為通常涉及到大型的大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)既具有局部的連接又具有遠程的連接。要想將神經(jīng)元活動與行為聯(lián)系起來，需要同時監(jiān)控非常龐大且分布普遍的神經(jīng)元的活動，大腦中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)會在幾十毫秒內(nèi)處理傳入的刺激，要想了解這種快速的神經(jīng)元動力學，就需要MPM具備對神經(jīng)元進行快速成像的能力?？焖費PM方法可分為單束掃描技術(shù)和多束掃描技術(shù)。模塊化多光子顯微鏡實驗操作