美國(guó)在體多光子顯微鏡準(zhǔn)確定位

對(duì)于雙光子成像而言，離焦和近表面熒光激發(fā)是兩個(gè)比較大的深度限制因素，而對(duì)于三光子成像這兩個(gè)問題大大減小，但是三光子成像由于熒光團(tuán)的吸收截面比2P要小得多，所以需要更高數(shù)量級(jí)的脈沖能量才能獲得與2P激發(fā)的相同強(qiáng)度的熒光信號(hào)。功能性3P顯微鏡比結(jié)構(gòu)性3P顯微鏡的要求更高，它需要更快速的掃描，以便及時(shí)采樣神經(jīng)元活動(dòng)；需要更高的脈沖能量，以便在每個(gè)像素停留時(shí)間內(nèi)收集足夠的信號(hào)。復(fù)雜的行為通常涉及到大型的大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)既具有局部的連接又具有遠(yuǎn)程的連接。要想將神經(jīng)元活動(dòng)與行為聯(lián)系起來，需要同時(shí)監(jiān)控非常龐大且分布普遍的神經(jīng)元的活動(dòng)，大腦中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)會(huì)在幾十毫秒內(nèi)處理傳入的刺激，要想了解這種快速的神經(jīng)元?jiǎng)恿W(xué)，就需要MPM具備對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行快速成像的能力。快速M(fèi)PM方法可分為單束掃描技術(shù)和多束掃描技術(shù)。點(diǎn)掃描多光子顯微鏡可以深入樣本并捕捉高質(zhì)量的圖像，但這個(gè)過程極其緩慢，因?yàn)閳D像是一次形成一個(gè)點(diǎn)。美國(guó)在體多光子顯微鏡準(zhǔn)確定位

當(dāng)激光光束焦點(diǎn)的位置在鏡面上，此時(shí)被反射的激光在無限空間中成為準(zhǔn)直光束，并在OBJ2的焦平面上形成了一個(gè)激光光斑。同理，如果橫向掃描光束，則會(huì)形成遠(yuǎn)離傾斜鏡鏡面的焦點(diǎn)，這又導(dǎo)致返回的光束會(huì)聚或發(fā)散，進(jìn)而OBJ2能在軸向不同位置形成焦點(diǎn)，通過這種方式即能實(shí)現(xiàn)連續(xù)的軸向掃描。對(duì)于較小的傾斜角，聚焦沒有球差。該組在實(shí)驗(yàn)中表征了這種將橫向掃描轉(zhuǎn)換為軸向掃描技術(shù)的光學(xué)性能，并使用它將光片顯微鏡的成像速度提升了一個(gè)數(shù)量級(jí)，從而可以在三個(gè)維度上量化快速的囊泡動(dòng)力學(xué)。該組還演示了使用雙光子光柵掃描顯微鏡以12 kHz進(jìn)行共振遠(yuǎn)程聚焦，該技術(shù)可對(duì)大腦組織和斑馬魚心臟動(dòng)力學(xué)進(jìn)行快速成像，并具有衍射極限的分辨率。 美國(guó)模塊化多光子顯微鏡作用多光子顯微鏡的分辨率比傳統(tǒng)的單光子共聚焦要低的多。

國(guó)內(nèi)顯微鏡制造市場(chǎng)目前斷層嚴(yán)重。目前我國(guó)顯微鏡行業(yè)發(fā)展缺乏技術(shù)沉淀，20年以上經(jīng)營(yíng)積累的企業(yè)十分稀缺，深度精密制造、光學(xué)主要部件設(shè)計(jì)及工藝嚴(yán)重制約產(chǎn)業(yè)升級(jí)。目前中國(guó)顯微鏡中如多光子顯微鏡、共聚焦掃描和電子顯微鏡等主要集中在徠卡顯微系統(tǒng)、蔡司、尼康、奧林巴斯等國(guó)外企業(yè)。國(guó)內(nèi)具備生產(chǎn)顯微鏡能力的企業(yè)屈指可數(shù)，若國(guó)內(nèi)顯微鏡企業(yè)能打破技術(shù)壁壘，切入顯微鏡市場(chǎng)，企業(yè)的生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)將騰躍至一個(gè)更高的格局。未來國(guó)產(chǎn)多光子激光掃描顯微鏡替代空間大。目前中國(guó)使用的多光子激光掃描顯微鏡幾乎被徠卡顯微系統(tǒng)、蔡司、尼康和奧林巴斯壟斷。國(guó)內(nèi)有能力開始生產(chǎn)多光子激光掃描顯微鏡的企業(yè)極少，若國(guó)內(nèi)能夠制造出高性能、高可靠性的多光子激光掃描顯微鏡，無異是會(huì)面臨極大的市場(chǎng)機(jī)遇。

使用基因編碼的熒光探針可以在突觸和細(xì)胞分辨率下監(jiān)測(cè)體內(nèi)神經(jīng)元信號(hào)，這是揭示動(dòng)物神經(jīng)活動(dòng)復(fù)雜機(jī)制的關(guān)鍵。使用雙光子顯微鏡（2PM）可以以亞細(xì)胞分辨率對(duì)鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器成像，從而測(cè)量不透明大腦深處的活動(dòng)；成像膜電壓變化能直接反映神經(jīng)元活動(dòng)，但神經(jīng)元活動(dòng)的速度對(duì)于常規(guī)的2PM來說太快。目前電壓成像主要通過寬場(chǎng)顯微鏡實(shí)現(xiàn)，但它的空間分辨率較差并且于淺層深度。因此要在不透明的大腦中以高空間分辨率對(duì)膜電壓變化進(jìn)行成像，需要明顯提高2PM的成像速率。使用雙光子顯微鏡觀察標(biāo)本的時(shí)候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。

多光子顯微鏡對(duì)成像深度的改善利用紅光或紅外光激發(fā)，光散射?。ㄐ×Ｗ拥纳⑸渑c波長(zhǎng)的四次方的成反比）。不需要***，能更多收集來自成像截面的散射光子。***不能區(qū)分由離焦區(qū)域或焦點(diǎn)區(qū)發(fā)射出的散射光子，多光子在深層成像信噪比好。單光子激發(fā)所用的紫外或可見光在光束到達(dá)焦平面之前易被樣品吸收而衰減，不易對(duì)深層激發(fā)。多光子熒光成像的特點(diǎn)。深度成像∶與共聚焦相比能更好地對(duì)厚散射物質(zhì)成像。信噪比∶多光子吸收采用的波長(zhǎng)是單光子吸收的2倍以上，所以顯微試樣中的瑞利散射更小，熒光測(cè)定的信噪比更高。觀察活細(xì)胞∶離子測(cè)量（i.e.Ca2+），GFP，發(fā)育生物學(xué)等—減少了光毒性和光漂白，能對(duì)細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間觀察。多光子顯微鏡涉及醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、化學(xué)、物理學(xué)、電子學(xué)、工程學(xué)等學(xué)科，生產(chǎn)工藝相對(duì)復(fù)雜，進(jìn)入門檻較高。共聚焦多光子顯微鏡數(shù)據(jù)處理

目前主要使用的多光子顯微鏡包括雙光子顯微鏡和三光子顯微鏡。美國(guó)在體多光子顯微鏡準(zhǔn)確定位

多光子激發(fā)在紫外成像的優(yōu)勢(shì)在可見光脈沖中能得到紫外衍射的顯微觀察像。即使不使用紫外域光源、光學(xué)元件用可見光源、光學(xué)元件就能得到紫外光激勵(lì)的高空間分辨率圖像。多光子在生物成像中的優(yōu)勢(shì)在生物顯微鏡觀察方面，較早考慮的是不損壞生物本身的活性狀態(tài)，維持水分、離子濃度、氧和養(yǎng)分的流通。在光觀察場(chǎng)合，無論是熱還是光子能量方面都必須停留在細(xì)胞不受損傷的照射量、光能量?jī)?nèi)。多光子顯微鏡則能夠滿足此，而且還具有很多優(yōu)點(diǎn)。如三維分辨率、深度侵入、在散射效率、背景光、信噪比、控制等方面，均有以往激光顯微鏡不具備，或具有無法比擬的超越特性。美國(guó)在體多光子顯微鏡準(zhǔn)確定位