激光掃描多光子顯微鏡單分子成像定位

單光子激發(fā)熒光和雙光子激發(fā)熒光，是從熒光產(chǎn)生的機(jī)理上來區(qū)分的。而共焦則是熒光顯微鏡的一種結(jié)構(gòu)，其目的是為了，通過共焦結(jié)構(gòu)，提高整個熒光顯微鏡的空間分辨率。所以共焦熒光顯微鏡可以根據(jù)激發(fā)光源的不同，實(shí)現(xiàn)單光子共焦熒光成像或者雙光子共焦熒光成像。往往一個普通的雙光子熒光顯微鏡（沒有共焦結(jié)構(gòu)）其空間分辨率也可以達(dá)到單光子共焦熒光顯微鏡的水平。這樣就可以簡化整個系統(tǒng)，相對來說，就提高了激發(fā)光源的利用率，以及熒光的探測效率，這個也是我們提倡雙光子熒光成像的原因之一。雙光子熒光共焦顯微鏡由于雙光子效應(yīng)和共焦結(jié)構(gòu)，分辨率則會更高，而我們通常說的共焦顯微鏡都是指單光子激發(fā)熒光的。使用雙光子顯微鏡觀察標(biāo)本的時候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。激光掃描多光子顯微鏡單分子成像定位

從產(chǎn)品類型及技術(shù)方面來看，正置顯微鏡占據(jù)絕大多數(shù)市場。2020年，全球多光子激光掃描正置顯微鏡市場達(dá)到87.30百萬美元，預(yù)計到2027年該部分市場將達(dá)到154.02百萬美元，年復(fù)合增長率（2021-2027）為8.48%。中國多光子激光掃描正置顯微鏡市場達(dá)到13.32百萬美元，預(yù)計到2027年該部分市場將達(dá)到25.21百萬美元，年復(fù)合增長率（2021-2027）為9.58%。從產(chǎn)品市場應(yīng)用情況來看，研究機(jī)構(gòu)為主要應(yīng)用領(lǐng)域，2020年約占全球市場46.28%。2020年，全球多光子激光掃描顯微鏡研究機(jī)構(gòu)應(yīng)用消費(fèi)量為174臺，預(yù)計2027年達(dá)到349臺，2021-2027年復(fù)合增長率（CAGR）為9.72%。激光掃描多光子顯微鏡單分子成像定位多光子顯微鏡適用于動物大腦皮層深層（400微米）細(xì)胞的形態(tài)、生理學(xué)研究。

現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展和科技的進(jìn)步，特別是隨著后基因組時代的到來，人們已經(jīng)能夠根據(jù)需要建立各種細(xì)胞模型，為在體研究基因表達(dá)規(guī)律、分子間的相互作用、細(xì)胞的增殖、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、誘導(dǎo)分化、細(xì)胞凋亡以及新的血管生成等提供了良好的生物學(xué)條件。然而，盡管人們利用現(xiàn)有的分子生物學(xué)方法，已經(jīng)對基因表達(dá)和蛋白質(zhì)之間的相互作用進(jìn)行了深入、細(xì)致的研究，但仍然不能實(shí)現(xiàn)對蛋白質(zhì)和基因活動的實(shí)時、動態(tài)監(jiān)測。在細(xì)胞的生理過程中，基因、尤其是蛋白質(zhì)的表達(dá)、修飾和相萬作用往往發(fā)生可逆的、動態(tài)的變化。目前的分子生物學(xué)方法還不能捕獲到蛋白質(zhì)和基因的這些變化，但獲取這些信息對與研究基因的表達(dá)和蛋白質(zhì)之間的相互作用又至關(guān)重要。因此，發(fā)展能用于、動態(tài)、實(shí)時、連續(xù)監(jiān)測蛋白質(zhì)和基因活動的方法是非常有必要的。

當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時，隨著刺激時間的增加，即使繼續(xù)刺激，Ca2+熒光信號也不會繼續(xù)增強(qiáng)，反而會減弱，直至恢復(fù)到無刺激時的水平。對于細(xì)胞受精過程中Ca2+熒光信號的變化，發(fā)現(xiàn)粘附過程中Ca2+熒光信號沒有變化，但當(dāng)配子融合時，Ca2+熒光信號強(qiáng)度出現(xiàn)一個不穩(wěn)定的峰值，持續(xù)數(shù)分鐘。這些現(xiàn)象對于研究受精發(fā)育的早期信號以及Ca2+在卵子和受精卵發(fā)育中的作用具有重要意義。在其他生理過程中，如細(xì)胞分裂和胞吐，Ca2+熒光信號的強(qiáng)度也會發(fā)生很大的變化。多光子顯微鏡在臨床前評價IA形態(tài)、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞密度和血管形成等方面顯示出強(qiáng)大的作用。

2020年，TonmoyChakraborty等人提出了加速2PM軸向掃描速度的方法[2]。在光學(xué)顯微鏡中，物鏡或樣品緩慢的軸向掃描速度限制了體成像的速度。近年來，通過使用遠(yuǎn)程聚焦技術(shù)或電調(diào)諧透鏡(ETL)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了快速軸向掃描。但遠(yuǎn)程對焦時對反射鏡的機(jī)械驅(qū)動會限制軸向掃描速度，ETL會引入球差和高階像差，無法進(jìn)行高分辨率成像。為了克服這些限制，該小組引入了一種新的光學(xué)設(shè)計，可以將橫向掃描轉(zhuǎn)換為無球面像差的軸向掃描，以實(shí)現(xiàn)高分辨率成像。有兩種方法可以實(shí)現(xiàn)這種設(shè)計。***個可以執(zhí)行離散的軸向掃描，另一個可以執(zhí)行連續(xù)的軸向掃描。如圖3a所示，特定裝置由兩個垂直臂組成，每個臂具有4F望遠(yuǎn)鏡和物鏡。遠(yuǎn)程聚焦臂由振鏡掃描鏡(GSM)和空氣物鏡(OBJ1)組成，另一個臂(稱為照明臂)由浸沒物鏡(OBJ2)組成。兩個臂對齊，使得GSM與兩個物鏡的后焦平面共軛。準(zhǔn)直后的激光束經(jīng)偏振分束器反射進(jìn)入遠(yuǎn)程聚焦臂，由GSM進(jìn)行掃描，使OBJ1產(chǎn)生的激光焦點(diǎn)可以進(jìn)行水平掃描。滔博生物-三維顯微鏡-適用于各行各業(yè)的觀察需求!激光掃描多光子顯微鏡單分子成像定位

與傳統(tǒng)的熒光顯微鏡相比，多光子顯微鏡具有更好的深度穿透能力和較低光損傷性，可以觀察更深層的組織結(jié)構(gòu)。激光掃描多光子顯微鏡單分子成像定位

有許多方法可以實(shí)現(xiàn)快速光柵掃描，例如使用振鏡進(jìn)行快速2D掃描，以及將振鏡與可調(diào)電動透鏡相結(jié)合進(jìn)行快速3D掃描。而可調(diào)電動式鏡頭由于機(jī)械慣性的限制，無法在軸向快速切換焦點(diǎn)，影響成像速度。現(xiàn)在它可以被空間光調(diào)制器(SLM)取代。遠(yuǎn)程對焦也是實(shí)現(xiàn)3D成像的一種手段，如圖2所示。LSU模塊中，掃描振鏡水平掃描，ASU模塊包括物鏡L1和反射鏡M，通過調(diào)整M的位置實(shí)現(xiàn)軸向掃描該技術(shù)不僅可以校正主物鏡L2引入的光學(xué)像差，還可以進(jìn)行快速軸向掃描。為了獲得更多的神經(jīng)元成像，可以通過調(diào)整顯微鏡的物鏡設(shè)計來放大FOV。然而，大NA和大FOV的物鏡通常很重，不能快速移動以進(jìn)行快速軸向掃描，因此大FOV系統(tǒng)依賴于遠(yuǎn)程聚焦、SLM和可調(diào)電動透鏡。激光掃描多光子顯微鏡單分子成像定位