飛秒激光多光子顯微鏡飛秒激光

使用基因編碼的熒光探針可以在突觸和細(xì)胞分辨率下監(jiān)測體內(nèi)神經(jīng)元信號，這是揭示動物神經(jīng)活動復(fù)雜機(jī)制的關(guān)鍵。使用雙光子顯微鏡（2PM）可以以亞細(xì)胞分辨率對鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器成像，從而測量不透明大腦深處的活動；成像膜電壓變化能直接反映神經(jīng)元活動，但神經(jīng)元活動的速度對于常規(guī)的2PM來說太快。目前電壓成像主要通過寬場顯微鏡實現(xiàn)，但它的空間分辨率較差并且于淺層深度。因此要在不透明的大腦中以高空間分辨率對膜電壓變化進(jìn)行成像，需要明顯提高2PM的成像速率。光子顯微成像技術(shù)不是什么新技術(shù)，早在20多年前就有了，目前已經(jīng)在生命科學(xué)和材料科學(xué)中廣泛應(yīng)用。飛秒激光多光子顯微鏡飛秒激光

雙光子熒光顯微成像主要有以下優(yōu)點∶a.光損傷小∶雙光子熒光顯微鏡使用可見光或近紅外光作為激發(fā)光，對細(xì)胞和組織的光損傷很小，適合于長時間的研究;b.穿透能力強(qiáng)∶相對于紫外光，可見光或近紅外光具有很強(qiáng)的穿透性，可以對生物樣品進(jìn)行深層次的研究;c．高分辨率∶由于雙光子吸收截面很小P，只有在焦平面很小的區(qū)域內(nèi)可以激發(fā)出熒光，雙光子吸收局限于焦點處的體積約為λ范圍內(nèi);d.漂白區(qū)域很小，焦點以外不發(fā)生漂白現(xiàn)象。e．熒光收集率高。與共聚焦成像相比，雙光子成像不需要光學(xué)濾波器，提高了熒光收集率。收集效率提高直接導(dǎo)致圖像對比度提高。f.對探測光路的要求低。由于激發(fā)光與發(fā)射熒光的波長差值加大以及自發(fā)的三維濾波效果，多光子顯微鏡對光路收集系統(tǒng)的要求比單光子共焦顯微鏡低得多，光學(xué)系統(tǒng)相對簡單。g.適合多標(biāo)記復(fù)合測量。許多染料熒光探針的多光子激發(fā)光譜要比單光子激發(fā)譜寬闊，這樣，可以利用單一波長的激發(fā)光同時激發(fā)多種染料，從而得到同一生命現(xiàn)象中的不同信息，便于相互對照、補(bǔ)充。靈長類多光子顯微鏡系統(tǒng)多光子顯微鏡已經(jīng)被生物學(xué)家普遍的運(yùn)用于實驗中。

    多光子顯微鏡因擁有較深的成像深度，和較高的對比度在生物成像中有著重要的意義，但是它通常需要較高的功率。結(jié)合時間上展開的超短脈沖可以實現(xiàn)超快的掃描速度和較深的成像深度，但是其本身所利用的近紅外波段的光會導(dǎo)致分辨率較低。清華大學(xué)陳宏偉教授和北京大學(xué)席鵬研究員合作研究，結(jié)合了結(jié)構(gòu)光成像和上轉(zhuǎn)化粒子，開發(fā)了一種基于多光子上轉(zhuǎn)化材料和時間編碼結(jié)構(gòu)光顯微鏡的高速超分辨成像系統(tǒng)(MUTE-SIM)。它可以實現(xiàn)50MHz的超高的掃描速度，并突破了衍射極限，實現(xiàn)了超分辨成像。相較于普通的熒光顯微鏡，該顯微鏡提升了，并且只需要較低的激發(fā)功率。這種超快、低功率、多光子的超分辨技術(shù)，在分辨率高的生物深層組織成像上有著長遠(yuǎn)的應(yīng)用前景。

使用MPM對神經(jīng)元進(jìn)行成像時，通過隨機(jī)訪問掃描—即激光束在整個視場上的任意選定點上進(jìn)行快速掃描—可以只掃描感興趣的神經(jīng)元，這樣不僅避免掃描到任何未標(biāo)記的神經(jīng)纖維，還可以優(yōu)化激光束的掃描時間。隨機(jī)訪問掃描可以通過聲光偏轉(zhuǎn)器（AOD）來實現(xiàn)，其原理是將具有一個射頻信號的壓電傳感器粘在合適的晶體上，所產(chǎn)生的聲波引起周期性的折射率光柵，激光束通過光柵時發(fā)生衍射。通過射頻電信號調(diào)控聲波的強(qiáng)度和頻率從而可以改變衍射光的強(qiáng)度和方向，這樣使用1個AOD就可以實現(xiàn)一維橫向的任意點掃描，利用1對AOD，結(jié)合其他軸向掃描技術(shù)可實現(xiàn)3D的隨機(jī)訪問掃描。但是該技術(shù)對樣本的運(yùn)動很敏感，易出現(xiàn)運(yùn)動偽影。目前，快速光柵掃描即在FOV中進(jìn)行逐行掃描，由于利用算法可以輕松解決運(yùn)動偽影而被普遍的使用。多光子顯微鏡技術(shù)是對完整組織進(jìn)行深層熒光成像的優(yōu)先技術(shù)。

    在生物成像中，我司多光子顯微鏡具有清（清晰），快（快速），深（深層），活這四個方面。結(jié)合了多光子上轉(zhuǎn)化材料以及時間編碼的結(jié)構(gòu)光超分辨技術(shù)，實現(xiàn)了快速（50MHz的掃描速度），超分辨（超衍射極限）成像。作為一種新的高速，超高分辨率的成像系統(tǒng)，MUTE-SIM可以幫助我們對快速運(yùn)動的生物圖像進(jìn)行分辨率高的成像。盡管關(guān)于深度成像的應(yīng)用我們沒有進(jìn)一步展示，但是結(jié)合1560nm近紅外光相對于可見光更佳的穿透性，我們相信該技術(shù)將有利于對生物組織進(jìn)行高速，超分辨，高深度地成像，有助于生物影像學(xué)的發(fā)展。滔博生物TOP-Bright是一家集研發(fā)，生產(chǎn)，銷售于一體的專注于神經(jīng)科學(xué)產(chǎn)品及致力于向高校、科研機(jī)構(gòu)等領(lǐng)域提供實驗室一體化方案的高科技企業(yè)。業(yè)務(wù)服務(wù)范圍已遍布至全國各地幾百家實驗室。目前公司主營產(chǎn)品是享譽(yù)全球的國際品牌和產(chǎn)品,這些儀器設(shè)備都是科學(xué)研究所必備且不可替代的基礎(chǔ)儀器。 多光子顯微鏡作為一種研究微觀結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)，在眾多領(lǐng)域得到了普遍的應(yīng)用。美國熒光多光子顯微鏡Ultima 2P Plus

多光子顯微鏡市場集中，由于投產(chǎn)生產(chǎn)的成本較高，技術(shù)難度大，目前涌現(xiàn)的新企業(yè)不多。飛秒激光多光子顯微鏡飛秒激光

多光子激光掃描顯微鏡行業(yè)發(fā)展，世界多光子激光掃描顯微鏡產(chǎn)業(yè)主要布局在德國和日本，德國是以徠卡顯微系統(tǒng)和蔡司為，而日本以尼康和奧林巴斯公司為，2020年，上述企業(yè)占據(jù)著世界多光子激光掃描顯微鏡市場 64.44%的市場份額，其發(fā)展戰(zhàn)略左右著多光子激光掃描顯微鏡市場的走向。目前世界市場對多光子激光掃描顯微鏡的需求在增長，中國市場這方面的需求增長更快，未來五年多光子激光掃描顯微鏡市場的發(fā)展在中國將具有很大的發(fā)展?jié)摿?。飛秒激光多光子顯微鏡飛秒激光