靈長(zhǎng)類多光子顯微鏡系統(tǒng)

    雙光子顯微鏡工作原理是將超快的紅外激光脈沖傳輸?shù)綐悠分?，在樣品中與組織或熒光標(biāo)記相互作用，這些組織或熒光標(biāo)記發(fā)出用于創(chuàng)建圖像的信號(hào)。雙光子顯微鏡被多用于生物學(xué)研究，因?yàn)樗軌虍a(chǎn)生高分辨率的3-D圖像，深度達(dá)1毫米。然而，這些優(yōu)點(diǎn)帶來(lái)了有限的成像速度，因?yàn)槲⒐鈼l件需要逐點(diǎn)圖像采集和重建的點(diǎn)檢測(cè)器。為了加快成像速度，科學(xué)家之前開(kāi)發(fā)了一種多焦點(diǎn)激光照明方法，該方法使用數(shù)字微鏡設(shè)備(DMD)，這是一種通常用于投影儀的低成本光掃描儀。此前人們認(rèn)為這些DMD不能與超快激光一起工作。然而現(xiàn)在解決了這個(gè)問(wèn)題，這使得DMD在超快激光應(yīng)用中得以應(yīng)用，這些應(yīng)用包括光束整形、脈沖整形、快速掃描和雙光子成像。DMD在樣品內(nèi)隨機(jī)選擇的位置上產(chǎn)生5到30點(diǎn)聚焦激光。 多光子顯微鏡技術(shù)的優(yōu)勢(shì)如何？又有哪些應(yīng)用？靈長(zhǎng)類多光子顯微鏡系統(tǒng)

細(xì)胞在受到外界刺激時(shí)，隨著刺激時(shí)間的增長(zhǎng)，即使刺激繼續(xù)存在，Ca2+熒光信號(hào)不但不會(huì)繼續(xù)增強(qiáng)，反而會(huì)減弱，直至恢復(fù)到未加刺激物時(shí)的水平。對(duì)于細(xì)胞受精過(guò)程中 Ca2+熒光信號(hào)的變化情況，研究發(fā)現(xiàn)，配了在粘著過(guò)程中，Ca2+熒光信號(hào)未發(fā)生任何變化，而配子之間發(fā)生融合作用時(shí)，Ca2+熒光信號(hào)強(qiáng)度卻會(huì)出現(xiàn)一個(gè)不穩(wěn)定的峰值，并可持續(xù)幾分鐘。這些現(xiàn)象，對(duì)研究受精發(fā)育的早期信號(hào)及 Ca2+在卵細(xì)胞和受精卵的發(fā)育過(guò)程中的作用具有重要的意義。在其它一些生理過(guò)程如細(xì)胞分裂、胞吐作用等，Ca2+熒光信號(hào)強(qiáng)度也會(huì)發(fā)生很的變化。多光子顯微鏡作用多光子顯微鏡可以更好的了解神經(jīng)信號(hào)之間復(fù)雜動(dòng)態(tài)的編碼過(guò)程。

對(duì)于雙光子成像而言，離焦和近表面熒光激發(fā)是兩個(gè)比較大的深度限制因素，而對(duì)于三光子成像這兩個(gè)問(wèn)題大大減小，但是三光子成像由于熒光團(tuán)的吸收截面比2P要小得多，所以需要更高數(shù)量級(jí)的脈沖能量才能獲得與2P激發(fā)的相同強(qiáng)度的熒光信號(hào)。功能性3P顯微鏡比結(jié)構(gòu)性3P顯微鏡的要求更高，它需要更快速的掃描，以便及時(shí)采樣神經(jīng)元活動(dòng)；需要更高的脈沖能量，以便在每個(gè)像素停留時(shí)間內(nèi)收集足夠的信號(hào)。復(fù)雜的行為通常涉及到大型的大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)既具有局部的連接又具有遠(yuǎn)程的連接。要想將神經(jīng)元活動(dòng)與行為聯(lián)系起來(lái)，需要同時(shí)監(jiān)控非常龐大且分布普遍的神經(jīng)元的活動(dòng)，大腦中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)會(huì)在幾十毫秒內(nèi)處理傳入的刺激，要想了解這種快速的神經(jīng)元?jiǎng)恿W(xué)，就需要MPM具備對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行快速成像的能力。快速M(fèi)PM方法可分為單束掃描技術(shù)和多束掃描技術(shù)。

快速光柵掃描有多種實(shí)現(xiàn)方式，使用振鏡進(jìn)行快速2D掃描，將振鏡和可調(diào)電動(dòng)透鏡結(jié)合在一起進(jìn)行快速3D掃描，但可調(diào)電動(dòng)透鏡由于機(jī)械慣性的限制在軸向無(wú)法快速進(jìn)行焦點(diǎn)切換，影響成像速度，現(xiàn)可使用空間光調(diào)制器（SLM）代替。遠(yuǎn)程聚焦也是一種實(shí)現(xiàn)3D成像的手段，如圖2所示。在LSU模塊中，掃描振鏡進(jìn)行橫向掃描，ASU模塊包括物鏡L1和反射鏡M，通過(guò)調(diào)控M的位置實(shí)現(xiàn)軸向掃描。該技術(shù)不僅可以校正主物鏡L2引入的光學(xué)像差，還可以進(jìn)行快速的軸向掃描。想要獲得更多神經(jīng)元成像，可以通過(guò)調(diào)整顯微鏡的物鏡設(shè)計(jì)來(lái)擴(kuò)大FOV，但是具有大NA和大FOV的物鏡通常重量較大，無(wú)法快速移動(dòng)以進(jìn)行快速軸向掃描，因此大型FOV系統(tǒng)依賴于遠(yuǎn)程聚焦、SLM和可調(diào)電動(dòng)透鏡。多光子顯微鏡的大多數(shù)補(bǔ)償器都采用棱鏡。

隨著生物分子光學(xué)標(biāo)記技術(shù)的不斷進(jìn)步，光學(xué)技術(shù)在揭示生命活動(dòng)基本規(guī)律的研究中正發(fā)揮越來(lái)越重要的作用，也為醫(yī)學(xué)診療提供了更多、更有效的手段。生物醫(yī)學(xué)光學(xué)（BiomedicalOptics）是近年來(lái)受到國(guó)際光學(xué)界和生物醫(yī)學(xué)界關(guān)注的研究熱點(diǎn)，在生物活檢、光動(dòng)力、細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能檢測(cè)、基因表達(dá)規(guī)律的在體研究等問(wèn)題上取得了一系列研究成果，目前正在從宏觀到微觀上對(duì)大腦活動(dòng)與功能進(jìn)行多層面的研究。細(xì)胞重大生命活動(dòng)（包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)）的發(fā)生和調(diào)節(jié)是通過(guò)生物大分子間（如蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-核酸等）相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。蛋白質(zhì)作為基因調(diào)控的產(chǎn)物，與細(xì)胞和機(jī)體生理過(guò)程代謝直接相關(guān)，深入研究基因表達(dá)及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用不僅能揭示生命活動(dòng)的基本規(guī)律，同時(shí)也能深入了解疾病發(fā)生的分子機(jī)理，進(jìn)而為尋找更有效的藥物分子、提高藥物篩選和藥物設(shè)計(jì)的效率提供新的方法和思路。多光子共聚焦掃描顯微鏡比雙光子共聚焦掃描顯微鏡具有更高的空間分辨率。靈長(zhǎng)類多光子顯微鏡系統(tǒng)

多光子顯微鏡在基礎(chǔ)科學(xué)和臨床診斷領(lǐng)域的應(yīng)用范圍正在持續(xù)增長(zhǎng)。靈長(zhǎng)類多光子顯微鏡系統(tǒng)

單束掃描技術(shù)可以高速遍歷大視場(chǎng)（FOV）的神經(jīng)組織：使用MPM對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行成像時(shí)，通過(guò)隨機(jī)訪問(wèn)掃描—即激光束在整個(gè)視場(chǎng)上的任意選定點(diǎn)上進(jìn)行快速掃描—可以只掃描感興趣的神經(jīng)元，這樣不僅避免掃描到任何未標(biāo)記的神經(jīng)纖維，還可以優(yōu)化激光束的掃描時(shí)間。隨機(jī)訪問(wèn)掃描（圖1）可以通過(guò)聲光偏轉(zhuǎn)器（AOD）來(lái)實(shí)現(xiàn)，其原理是將具有一個(gè)射頻信號(hào)的壓電傳感器粘在合適的晶體上，所產(chǎn)生的聲波引起周期性的折射率光柵，激光束通過(guò)光柵時(shí)發(fā)生衍射。通過(guò)射頻電信號(hào)調(diào)控聲波的強(qiáng)度和頻率從而可以改變衍射光的強(qiáng)度和方向，這樣使用1個(gè)AOD就可以實(shí)現(xiàn)一維橫向的任意點(diǎn)掃描，利用1對(duì)AOD，結(jié)合其他軸向掃描技術(shù)可實(shí)現(xiàn)3D的隨機(jī)訪問(wèn)掃描。但是該技術(shù)對(duì)樣本的運(yùn)動(dòng)很敏感，易出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)偽影。目前，快速光柵掃描即在FOV中進(jìn)行逐行掃描，由于利用算法可以輕松解決運(yùn)動(dòng)偽影而被普遍的使用。靈長(zhǎng)類多光子顯微鏡系統(tǒng)