美國激光熒光雙光子顯微鏡的原理

后續(xù)實驗使用碘化丙啶(PI)來指示細胞在7、8、9和10分鐘的延時觀察后的損傷情況，來驗證該光學系統(tǒng)對活細胞長期觀察的適用性。在觀察期間，88個焦點以100毫秒的曝光時間，曝光間隔1s照射樣品，激發(fā)強度為3.21×104W/cm2，激發(fā)波長為525nm，使用前文提到的60×物鏡及1.0AU孔徑，圖5(a)-(d)為引入PI的成像圖，(e)-(h)為相應的相應襯度圖。改變激發(fā)條件為每照射500ms間隔5s，得到相應的(i)-(p)。由圖像可知，延時觀察小于8分鐘的情況下不造成可見細胞損傷，對于實際3D延時成像，由于焦平面是移動的，所以預期細胞存活時間會更長，可見這是一種在3D在體延時成像中具有很大優(yōu)勢的成像方案。雙光子顯微鏡廠家就找因斯蔻浦(上海)生物科技有限公司；美國激光熒光雙光子顯微鏡的原理

雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎得主提出，30年后因為有了激光才得到實驗驗證，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年。要理解雙光子的技術挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用，首先要了解其中的非線性過程。雙光子吸收相當于和頻產(chǎn)生非線性過程，這要求極高的電場強度，而電場取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小，脈寬越窄，雙光子吸收效率越高。對于衍射極限顯微鏡，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長有關，所以關鍵變量只剩下激光脈寬。基于以上分析，能夠以高重頻(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標準激發(fā)光源。這也再次說明雙光子顯微鏡的優(yōu)勢：只有焦平面處才能形成雙光子吸收，而焦平面之外由于光強低無法被激發(fā)，所以雙光子成像更清晰。WinfriedDenk初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬、630nm可見光波長)。雖然染料激光器對于實驗室演示尚可，但是使用很不方便所以遠未實現(xiàn)商用。很快雙光子顯微鏡的標配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態(tài)光源優(yōu)勢，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調(diào)諧范圍，而近紅外相比可見光穿透更深，對生物樣品損傷更小。激光雙光子顯微鏡分辨率雙光子顯微鏡不需要共聚焦細孔，提高了熒光檢測效率。

和很多偉大的科學發(fā)明一樣，雙光子顯微鏡的出現(xiàn)也有一點偶然，但正是那瞬間的靈感為生物科學尤其是神經(jīng)科學帶來了一種**性的成像技術：雙光子激發(fā)熒光顯微鏡。1990年初，當WinfriedDenk剛從康奈爾大學博士畢業(yè)準備前往瑞士讀博后時，他看了一本關于激光掃描顯微鏡的書，從中了解到非線性光學效應——強光和物質(zhì)的相互作用。當時，Denk有同事研究生物樣品中的鈣離子但苦于沒有強大的紫外激光器和光學元件，于是他就想到如果使用雙光子吸收就能夠繞開紫外，換言之，與其通過一個紫外光子激發(fā)標記的鈣離子，通過兩個雙倍波長的可見光光子也能激發(fā)相同的熒光。有了想法后馬上實驗。借了一套染料飛秒激光器，Denk聯(lián)合他的導師WattWebb及其博士生JamesStrickler只用六個小時就完成了實驗搭建，采集數(shù)據(jù)則用了兩到三天，于是一篇里程碑式的文章就此誕生了。

對生物樣品的三維觀測是了解細胞功能的重要方法之一。目前已有的三維熒光成像技術包括光片顯微成像技術、晶格光照明技術以及激光掃描顯微成像技術（如共聚焦顯微鏡及雙光子顯微鏡）等。其中激光掃描顯微鏡利用旋轉(zhuǎn)盤可以進行多焦點的激光掃描，提高時間分辨率，而且有利于減少活細胞成像中的光損傷。本篇文獻主要實現(xiàn)了可見光雙光子激發(fā)及多焦點激光掃描的結合，終提高了3D延時掃描中的空間分辨率及成像對比度，同時這也是可見光雙光子激發(fā)（v2PE）在超高分辨率顯微鏡中的應用。雙光子顯微鏡的探測器,該怎么選用?

新一代微型化雙光子熒光顯微鏡體積小，重只2.2克，適于佩戴在小動物頭部顱窗上，實時記錄數(shù)十個神經(jīng)元、上千個神經(jīng)突觸的動態(tài)信號。在大型動物上，還可望實現(xiàn)多探頭佩戴、多顱窗不同腦區(qū)的長時程觀測。相比單光子激發(fā)，雙光子激發(fā)具有良好的光學斷層、更深的生物組織穿透等優(yōu)勢，其橫向分辨率達到0.65μm，成像質(zhì)量與商品化大型臺式雙光子熒光顯微鏡可相媲美，遠優(yōu)于目前領域內(nèi)主導的、美國腦科學計劃重要團隊所研發(fā)的微型化寬場顯微鏡。采用雙軸對稱高速微機電系統(tǒng)轉(zhuǎn)鏡掃描技術，成像幀頻已達40Hz（256*256像素），同時具備多區(qū)域隨機掃描和每秒1萬線的線掃描能力。此外，采用自主設計可傳導920nm飛秒激光的光子晶體光纖，該系統(tǒng)實現(xiàn)了微型雙光子顯微鏡對腦科學領域較廣泛應用的指示神經(jīng)元活動的熒光探針（如GCaMP6）的有效利用。 同時采用柔性光纖束進行熒光信號的接收，解決了動物的活動和行為由于熒光傳輸光纜拖拽而受到干擾的難題。未來，與光遺傳學技術的結合，可望在結構與功能成像的同時，精細地操控神經(jīng)元和神經(jīng)回路的活動。雙光子顯微鏡觀察到的現(xiàn)象證明了鈣離子的增加依賴于肌體觸發(fā)的鈉離子作用電勢。激光雙光子顯微鏡分辨率

雙光子顯微鏡可以精確穿透較厚標本進行定點、有生命體的觀察！美國激光熒光雙光子顯微鏡的原理

共聚焦顯微可以呈現(xiàn)這么漂亮的圖像，是不是什么樣品都可以用共聚焦顯微鏡拍拍拍.....得到各種各樣清晰漂亮的圖像呢？答案是否定的，任何事物都有優(yōu)缺點，何況一臺儀器呢，共聚焦顯微鏡也是有自己的局限,共聚焦有哪些局限呢：1.共聚焦顯微鏡只能拍攝約200um以內(nèi)的的樣品，對于厚的或者樣品不能進拍攝；2. 共聚焦顯微鏡由于是逐點進行掃描，對樣品的光毒性還是比較大的，特別是拍攝活細胞樣品時就更容易對樣品進行淬滅；3. 由于光照射的區(qū)域幾乎能通過這個Z軸的層面，所以對于空間定點光刺激的實驗定點位置就不是特別精確；并且激光共聚焦顯微鏡沒有純紫外進行激發(fā)，對于一些特殊激發(fā)波長的實驗，效率非常低。美國激光熒光雙光子顯微鏡的原理