青浦區(qū)疾病動物模型建模優(yōu)勢

    即為本發(fā)明構建的一種pirb基因敲入的小鼠動物模型。本發(fā)明所采用第二種技術方案的特點還在于，步驟1中得到grna1和grna2后分別與trancrrna在25℃孵育10min形成二級結構。步驟3中grna1、grna2的濃度均為2～10pmol/ul，cas9蛋白的注射濃度為30～100ng/μl。步驟4中southern雜交采用bamhi和avrii核酸內切酶切割f1代雜合子小鼠的dna。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供了pirb基因敲入的小鼠動物模型及其構建方法，本發(fā)明的小鼠動物模型對于pirb基因功能的研究和在體驗證提供了良好的基礎。分離自pirb基因敲入小鼠的細胞還可以用于研究pirb發(fā)揮調節(jié)作用的下游機制。通過pirb敲入動物模型與不同類型cre小鼠的雜交，可以用于研究ad不同***或不同細胞類型pirb的調節(jié)作用。附圖說明圖1為本發(fā)明pirb基因敲入的小鼠插入pirb基因cds和loxp位點的打靶質粒載體的構建圖；圖2為本發(fā)明pirb基因敲入的小鼠模型的構建方法的流程圖；圖3為本發(fā)明f1代pirb敲入的小鼠的基因型pcr結果鑒定電泳圖；圖4為本發(fā)明f1代pirb敲入的小鼠驗證pirb基因敲入效果的測序峰圖；圖5為本發(fā)明f1代pirb基因敲入的小鼠進行southern鑒定的方法示意圖；圖6為本發(fā)明f1代pirb基因敲入的小鼠進行southern鑒定的結果圖。動物模型的優(yōu)越性主要表現在以下幾下方面！青浦區(qū)疾病動物模型建模優(yōu)勢

    步驟3、pmsg處理c57bl/6雌性小鼠(6周齡，平均體重20g)，46h后注射hcg，與雄性小鼠合籠交配，次日取受精卵進行顯微注射，將步驟1的grna1、grna2、cas9蛋白以及線性化后的打靶載體一起注射到受精卵中，取注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠體內，產出小鼠，即f0代小鼠。上述步驟中grna1、grna2的濃度均為2～10pmol/ul，cas9蛋白的注射濃度為30～100ng/μl，cas9蛋白購自newenglandbiolabs，貨號為m0386m。步驟4、提取f0代小鼠尾部dna，pcr擴增產物測序，鑒定是否為嵌合體。本發(fā)明用于f0代小鼠pirb基因pcr鑒定的特異性引物如下：pcrprimers1(℃):5’armforwardprimer(f1):5’-tacgccacagggagtccaagaatg-3’5’kireverseprimer(r1):5’-gatggggagagtgaagcagaacg-3’pcrprimers2(℃):3’kiforwardprimer(f2):5’-ctgctgtccattccttattccatag-3’3’armreverseprimer(r2):5’-ctggaaatcaggctgcaaatctc-3’。primers1對應的擴增產物大小為，primers2對應的擴增產物為。用于f0代小鼠測序的引物如下：sequencingprimerforpcrproduct1:5’sequenceprimer(f3):5’-cacttgctctcccaaagtcgctc-3’sequencingprimerforpcrproduct2:3’sequenceprimer。虹口區(qū)品牌疾病動物模型建模動物疾病模型的另一個富有成效的用途。

    引起組織壞死，從而導致卵巢功能早衰。技術實現要素：針對上述現有技術，本發(fā)明提供了一種利用順鉑建立大鼠卵巢早衰模型的方法。本發(fā)明根據“順鉑可誘導卵巢細胞凋亡，引起組織壞死，從而導致卵巢功能早衰”這一原理，使用不同濃度及不同方法建立了化療性損傷卵巢早衰動物模型，并對比各種方法間的優(yōu)劣性，篩選出順鉑比較好的濃度及給藥時間，為篩選順鉑導致的卵巢早衰動物模型比較好劑量提供了一種操作簡單，成功率高，結果可靠的實驗方法。本發(fā)明是通過以下技術方案實現的：一種利用順鉑建立大鼠卵巢早衰模型的方法：將劑量為按體重一日2～3mg/kg的順鉑施用于大鼠，施用方式為腹腔注射，施用方法：連續(xù)施用7天，末次注射后第15天，得大鼠卵巢早衰模型?；颍簩┝繛榘大w重4～6mg/kg的順鉑施用于大鼠，施用方式為腹腔注射，施用方法：第1天、第8天施用；末次注射后第15天，得大鼠卵巢早衰模型。進一步地，可將順鉑溶于％氯化鈉溶液配置成順鉑注射液，然后注射。所述順鉑，可市場常規(guī)購買得到，比如齊魯制藥公司生產的順鉑。進一步地，注射期間每天稱量大鼠體重，注射后每周稱量2次；末次注射后15天，麻醉取血檢測***水平，取卵巢檢測對比卵巢重量。

1、動物模型名稱：高脂飼料致高脂血癥大鼠模型2、實驗動物種屬：SD大鼠3、實驗動物性別：雄性4、實驗動物年齡：成年5、實驗動物體重：180~220g1、實驗方法：大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)20天。分別于造模前和造模20天**，測定血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C的含量2、檢測標準：造模20天后模型組大鼠血清TC、TG、HDLC、LDLC均***增加，與對照組比較具統計學差異。1.提供動物模型構建過程中的原始實驗記錄及數據圖片。2.根據要求提供構建成功的模型動物或相關組織材料。避免了在人身上進行實驗所帶來的風險。

    圖2是從側面展示的壓迫元件插入椎間孔的結構示意圖。圖3是術后大鼠四肢表現情況。圖4是術后28天大鼠的雙下肢縮足閾值變化曲線圖。圖5是重復經顱磁刺激對大鼠背根神經壓迫模型的影響。具體實施方式以下通過具體的實施例對本發(fā)明的技術方案做進一步的描述。以下的實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是限制本發(fā)明的范圍。實施例1、模型的制備1、腹腔注射1％戊巴比妥鈉(40mg/kg)麻醉大鼠(220-250g)，背部剃毛，碘伏消毒背部皮膚，俯臥位固定于動物手術臺上，鋪無菌巾。2、于大鼠腰4到骶1水平左側作一2-3cm縱行切口，切開皮膚，鈍性分離椎旁肌至橫突上方，暴露腰4椎間孔，腰5椎間孔(椎旁肌可用自制拉鉤保持分離狀態(tài))。3、將2根***端11為4mm，第二端12為2mm，直徑為，第二端12置于腰4椎間孔及腰5椎間孔外。如圖1和2所示，可以看到腰4錐體1、腰5錐體2、腰6錐體3、l型棒10、腰4神經根4和腰5神經根5的位置關系。當l型棒10的***端11插入腰4錐體1的腰4椎間孔后，會對腰4神經根4起到壓迫作用；同樣的，當l型棒10的***端11插入腰5錐體2的腰5椎間孔后，會對腰5神經根5起到壓迫作用。從而達到模擬腰椎間盤突出壓迫神經根的目的，制備得到大鼠慢性背根神經壓迫模型。實驗動物向小型化的發(fā)展趨勢更有利于實驗者的日常管理和實驗操作。楊浦區(qū)疾病動物模型建模評價

小鼠是人類疾病理想的動物模型不僅因為小鼠在生理上與人類極為相似而且小鼠的遺傳資源非常豐富。青浦區(qū)疾病動物模型建模優(yōu)勢

    r3):5’-atactccgaggcggatcacaa-3’步驟4、鑒定為pirb基因敲入的f0代雄性小鼠7周齡、雌性小鼠6周齡分別與野生型異性小鼠交配獲得f1代雜合子小鼠，圖2為本發(fā)明f1代雜合子小鼠pirb基因敲除小鼠的流程圖，小鼠出生后20天進行pcr鑒定，若有陽性小鼠出生，則表示轉基因已經整合到生殖細胞。(1)通過pcr方法對獲得的f1代小鼠進行基因型的鑒定：(a)dna的提?。悍椒?：采用takaraminibestuniversalgenomicdnaextractionkit()來獲得高純度的基因組dna。步驟a.每只小鼠剪下一段尾巴(2～5mm)，放入離心管中，加入180μlbuffergl，20μl蛋白激酶k和10μlrnasea。步驟b.將步驟a離心管內于56℃孵育過夜。步驟c.過夜后12000rpm離心2min去除雜質。步驟d.加入200μlbuffergb和200μl無水乙醇，充分混勻。步驟e.將吸附柱放在收集管上，將步驟d得到的樣品加到吸附柱里，12000rpm離心2min，棄掉收集管中液體。步驟f.棄去液體后在吸附柱中加入500μlbufferwa，12000rpm離心1min，棄掉收集管中液體。步驟g.在收集管中加入700μlbufferwb，12000rpm離心1min。棄掉收集管中液體。注意：bufferwb需要與100％乙醇預混，沿管壁加入bufferwb沖走殘余的鹽。步驟h.重復步驟g一次。青浦區(qū)疾病動物模型建模優(yōu)勢

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