徐州實(shí)時(shí)數(shù)字PCR應(yīng)用

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見問題：Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特 異性，濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul?；?00ul，應(yīng)用多 大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。物理原因：變性對(duì)PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性；退火溫度過低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種用于放大擴(kuò)增特定的DN段的分子生物學(xué)技術(shù)。徐州實(shí)時(shí)數(shù)字PCR應(yīng)用

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：RNA和DNA的五碳糖，前者比后者多了一個(gè)O，由于多出來的O原子造成了RNA和DNA的堿基不同，即O原子造成U和T的不同，U分子化學(xué)式C4H4N2O2，T胸腺嘧啶化學(xué)式C5H6N2O2，現(xiàn)在將兩個(gè)分子式進(jìn)行對(duì)比，U比T多了CH2，結(jié)合前面的核糖區(qū)別，還有一個(gè)O分子，其余結(jié)構(gòu)相同，那么O和CH2之間的聯(lián)系是什么?是什么導(dǎo)致DNA和RNA的區(qū)別是RNA比DNA多了O和CH2？或者說如何將病毒的堿基中U變成DNA堿基中的T？若從結(jié)構(gòu)上說，直接從U中加入一個(gè)CH2，得到了T，這里面介入化學(xué)鍵的斷裂和重組，但是這樣一來的話，即使U變成了T，但是核糖依舊是RNA比DNA多了一個(gè)O分子，只是此時(shí)結(jié)構(gòu)是某分子=核糖（C4H9O4CHO）+堿基（A T G C），形成了RNA的五碳糖+DNA的堿基這種分子了。此時(shí)將這種分子導(dǎo)入受體細(xì)胞（亦或者蛋白質(zhì)）中，表達(dá)的性質(zhì)一定不同于病毒表達(dá)的性質(zhì)。常州分子生物學(xué)定量PCR服務(wù)重疊延伸聚合酶鏈反應(yīng)可以創(chuàng)造特定的長DNA構(gòu)建體。

PCR的反應(yīng)條件：Tm=4（G+c）+（A+T），一般在45～55度，溫度低容易退火但特異性低；溫度高，不容易退火但特異性高。退火時(shí)間30秒。延伸溫度一般在70～75度這時(shí)TaqDNA聚合酶活性很高（150個(gè)/S），當(dāng)引物在16個(gè)堿基以下時(shí)可采用緩慢升高溫度到70～75度的方法，使在低溫下就開始合成。一般<1KB時(shí)間1分鐘即可。當(dāng)〈1KB時(shí)在較后的循環(huán)中延長擴(kuò)增時(shí)間。循環(huán)次數(shù)25～30次。無產(chǎn)物時(shí)：取10ul擴(kuò)增混合液作模板在進(jìn)行PCR擴(kuò)增；增加TaqDNA聚合酶濃度；增加循環(huán)次數(shù)；降低退火溫度；加靶DNA量。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：定量PCR允許實(shí)時(shí)定量和檢測(cè)特定的DNA序列，因?yàn)樗诤铣蛇^程中測(cè)量濃度。有兩種方法可以同時(shí)檢測(cè)和定量。種方法是使用在DNA雙鏈之間非特異性保留的熒光染料。第二種方法涉及編碼特定序列并被熒光標(biāo)記的探針。只有在探針與其互補(bǔ)DNA雜交后，才能使用這些方法檢測(cè)DNA。一種有趣的技術(shù)組合是實(shí)時(shí)PCR和逆轉(zhuǎn)錄。這種復(fù)雜的技術(shù)被稱為RT-qPCR，允許定量少量RNA。通過這種組合技術(shù)，mRNA被轉(zhuǎn)化為cDNA，并用qPCR進(jìn)一步定量。這種技術(shù)降低了聚合酶鏈反應(yīng)終點(diǎn)出錯(cuò)的可能性，增加了檢測(cè)與遺傳疾病如病癥相關(guān)的基因的機(jī)會(huì)。實(shí)驗(yàn)室使用RT-qPCR來靈敏地測(cè)量基因調(diào)控。為了很大限度地減少污染的可能性，調(diào)查人員應(yīng)該為試劑制備、聚合酶鏈反應(yīng)和產(chǎn)品分析預(yù)留單獨(dú)的房間。

聚合酶鏈反應(yīng)的常見問題分析與解決方法：PCR產(chǎn)物量過少：退火溫度不合適。以2度為梯度設(shè)計(jì)梯度PCR反應(yīng)優(yōu)化退火溫度。DNA模板量太少。增加DNA模板量。PCR循環(huán)數(shù)不足。增加反應(yīng)循環(huán)數(shù)。引物量不足。增加體系中引物含量。延伸時(shí)間太短。以1 kb/min的原則設(shè)置延伸時(shí)間。變性時(shí)間過長。變性時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致DNA聚合酶失活。DNA模板中存在抑制劑。確保DNA模板干凈。擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠中涂布或成片狀條帶彌散：酶量過高。減少酶量；酶的質(zhì)量差，調(diào)換另一來源的酶。dNTP濃度過高。減少dNTP的濃度。PCR的很大特點(diǎn)是能將微量的DNA大幅增加。深圳實(shí)時(shí)Real-time PCR設(shè)計(jì)公司

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：模板的制備，PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。徐州實(shí)時(shí)數(shù)字PCR應(yīng)用

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：三步：變性：模板DNA加熱變性；復(fù)性，引物與它的靶序列發(fā)生退火，引物DNA量多，使引物和模板在局部形成雜交鏈；延伸，4種dNTP 與 Mg2+ 存在的條件下，DNA合成酶催化以引物為起始點(diǎn)，按5'-3'方向進(jìn)行延伸。上面三步為一個(gè)循環(huán)，可使拷貝數(shù)到達(dá)2*E－6-2*E－7。PCR產(chǎn)物一段雙鏈DNA，是由它的末端引物的5’端決定的。首輪擴(kuò)增，其產(chǎn)物是大小不均一的DNA分子。長度應(yīng)大于兩引物之間的長度。在第二個(gè)循環(huán)中，由于5'固定，其產(chǎn)物長度就由等于兩引物之間的長度。所以幾十個(gè)循環(huán)后就會(huì)產(chǎn)生大量的兩引物之間序列。徐州實(shí)時(shí)數(shù)字PCR應(yīng)用