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聚合酶鏈反應(yīng)允許快速生產(chǎn)短DN段，即使已知的引物序列不超過兩個。聚合酶鏈反應(yīng)的這種能力增強了許多方法，例如生成雜交 探針用于 Southern 或northern blot 雜交。聚合酶鏈反應(yīng)為這些技術(shù)提供了大量的純DNA，有時是單鏈的，甚至可以從非常少量的起始材料中進行分析。脫氧核糖核酸測序的任務(wù)也可以通過聚合酶鏈反應(yīng)來輔助完成。已知的DN段可以很容易地從患有遺傳疾病突變的患者體內(nèi)產(chǎn)生。對擴增技術(shù)的修飾可以從完全未知的基因組中提取片段，或者可以產(chǎn)生感興趣區(qū)域的單鏈。聚合酶鏈反應(yīng)有許多應(yīng)用于傳統(tǒng)的 DNA克隆。它可以從更大的基因組中提取片段以插入載體，這可能只有少量可用。使用一組“載體引物”，它還可以分析或提取已經(jīng)插入載體的片段。聚合酶鏈反應(yīng)方案的一些改變可以產(chǎn)生突變(通用的或定點的)插入片段。嵌套式PCR在特異性擴增長DN段方面通常比傳統(tǒng)PCR更成功，但它需要更詳細的目標(biāo)序列知識。廈門特殊樣本數(shù)字PCR哪家好

聚合酶鏈式反應(yīng)PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準備；模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基互補配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。廈門特殊樣本數(shù)字PCR哪家好聚合酶鏈反應(yīng)可用于產(chǎn)生突變基因，突變由科學(xué)家隨意選擇。

聚合酶鏈式反應(yīng)：反應(yīng)的控制：PCR反應(yīng)的緩沖液 提供合適的酸堿度與某些離子；鎂離子濃度 總量應(yīng)比dNTPs的濃度高，常用1.5mmol/L；底物濃度 dNTP以等摩爾濃度配制，20～200umol/L；TaqDNA聚合酶 2.5U(100ul）；引物濃度一般為0.1 ～ 0.5umol/L；反應(yīng)溫度和循環(huán)次數(shù)；變性溫度和時間 95℃，30s；退火溫度和時間 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃；延伸溫度和時間 72℃，1min/kb(10kb內(nèi)）；Tm值=4(G+C) +2(A+T)；循環(huán)次數(shù) ：一般為25 ～ 30次。循環(huán)數(shù)決定PCR擴增的產(chǎn)量。模板初始濃度低，可增加循環(huán)數(shù)以便達到有效的 擴增量。但循環(huán)數(shù)并不是可以無限增加的。一般循環(huán)數(shù)為30個左右，循環(huán)數(shù)超過30個以后，DNA聚合酶活性逐漸達到飽和，產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加，出現(xiàn)了所謂的“平臺期”。

聚合酶鏈反應(yīng)：等位基因特異性聚合酶鏈反應(yīng):基于單核苷酸變異的診斷或克隆技術(shù)(snv不要與 SNPs 混淆)(患者的單堿基差異)。它需要事先知道DNA序列，包括等位基因之間的差異，并使用3’端包含SNV的引物(通常包含SNV周圍的堿基對緩沖液)。在模板和引物不匹配的情況下，嚴格條件下的PCR擴增效率要低得多，因此用單核苷酸多態(tài)性特異性引物成功擴增表明序列中存在特異性單核苷酸多態(tài)性。有關(guān)更多信息，請參見單核苷酸多態(tài)性基因分型。裝配聚合酶鏈反應(yīng)或者聚合酶循環(huán)組件:通過對具有短重疊片段的長寡核苷酸池進行PCR來人工合成長DNA序列。寡核苷酸在有義和反義方向之間交替，重疊片段決定聚合酶鏈反應(yīng)片段的順序，從而選擇性地產(chǎn)生很終的長DNA產(chǎn)物。電子聚合酶鏈反應(yīng)用于計算理論聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果。

聚合酶鏈式反應(yīng)的常見問題：陰性：需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：選定一個好的引物合成單位。引物的濃度不但要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。引物設(shè)計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。PCR產(chǎn)物的電泳檢測時間一般為48h以內(nèi)，有些很好于當(dāng)日電泳檢測，大于48h后帶型不規(guī)則甚至消失。寧波微量熒光定量PCR供應(yīng)商

聚合酶鏈反應(yīng)的一個主要限制是，為了產(chǎn)生允許其選擇性擴增的引物，需要關(guān)于目標(biāo)序列的先前信息。廈門特殊樣本數(shù)字PCR哪家好

聚合酶鏈反應(yīng)注意事項：在實驗過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在總RNA的提取過程中，注意避免mRNA的斷裂；為了防止非特異性擴增，必須設(shè)陰性對照；內(nèi)參的設(shè)定：主要為了用于靶RNA的定量。常用的內(nèi)參有G3PD（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、β-Actin（β-肌動蛋白）等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應(yīng)體系中擴增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差；PCR不能進入平臺期，出現(xiàn)平臺效應(yīng)與所擴增的目的基因的長度、序列、二級結(jié)構(gòu)以及目標(biāo)DNA起始的數(shù)量有關(guān)。故對于每一個目標(biāo)序列出現(xiàn)平臺效應(yīng)的循環(huán)數(shù)，均應(yīng)通過單獨實驗來確定；防止DNA的污染： 采用DNA酶處理RNA； 在可能的情況下，將PCR引物置于基因的不同外顯子，以消除基因和mRNA的共線性。廈門特殊樣本數(shù)字PCR哪家好