常州組織RT-PCR檢測技術設計公司

聚合酶鏈式反應的常見問題：出現(xiàn)非特異性擴增帶：PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。其對策有：必要時重新設計引 物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。降低引物量，適當增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。適當提高退火溫度或采用二溫度點法（93℃變性，65℃左右退火與延伸）。聚合酶鏈式反應可看作是生物體外的特殊DNA復制。常州組織RT-PCR檢測技術設計公司

聚合酶鏈式反應：1976年，中國科學家，發(fā)現(xiàn)了穩(wěn)定的Taq DNA聚合酶，為PCR技術發(fā)展也做出了基礎性貢獻。PCR是利用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈，低溫（經(jīng)常是60°C左右）時引物與單鏈按堿基互補配對的原則結合，標本核酸模板在提取過程中，由于吸樣污染導致標本間污染；有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散再調(diào)溫度至DNA聚合酶很適反應溫度（72°C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈。基于聚合酶制造的PCR儀實際就是一個溫控設備，能在變性溫度，復性溫度，延伸溫度之間很好地進行控制。蘇州細胞PCR檢測技術應用聚合酶鏈式反應PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程。

聚合酶鏈式反應準備：引物內(nèi)部不應出現(xiàn)互補序列。兩個引物之間不應存在互補序列，尤其是避免3 ′端的互補重疊。引物與非特異擴增區(qū)的序列的同源性不要超過70%，引物3′末端連續(xù)8個堿基在待擴增區(qū)以外不能有完全互補序列，否則易導致非特異性擴增。引物3‘端的堿基，特別是很末及倒數(shù)第二個堿基，應嚴格要求配對，很好選擇是G和C。引物的5′端可以修飾。如附加限制酶位點，引入突變位點，用生物素、熒光物質(zhì)、地高辛標記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。

聚合酶鏈式反應的常見問題：靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣內(nèi)或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進頭等均應一次性使用。必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補后，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除?，F(xiàn)在有些PCR因為擴增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是很好也能在很短的時間內(nèi)復制完成。

聚合酶鏈式反應：定量PCR允許實時定量和檢測特定的DNA序列，因為它在合成過程中測量濃度。有兩種方法可以同時檢測和定量。種方法是使用在DNA雙鏈之間非特異性保留的熒光染料。第二種方法涉及編碼特定序列并被熒光標記的探針。只有在探針與其互補DNA雜交后，才能使用這些方法檢測DNA。一種有趣的技術組合是實時PCR和逆轉(zhuǎn)錄。這種復雜的技術被稱為RT-qPCR，允許定量少量RNA。通過這種組合技術，mRNA被轉(zhuǎn)化為cDNA，并用qPCR進一步定量。這種技術降低了聚合酶鏈反應終點出錯的可能性，增加了檢測與遺傳疾病如病癥相關的基因的機會。實驗室使用RT-qPCR來靈敏地測量基因調(diào)控。為了很大限度地減少污染的可能性，調(diào)查人員應該為試劑制備、聚合酶鏈反應和產(chǎn)品分析預留單獨的房間。常州組織RT-PCR檢測技術設計公司

熱啟動聚合酶鏈式反應可以通過將反應組分加熱到變性溫度在加入聚合酶之前。常州組織RT-PCR檢測技術設計公司

聚合酶鏈式反應是一種體外迅速擴增DN段的技術，它能以極少量的DNA為模版，在幾小時內(nèi)復制出上百萬份的DNA拷貝。DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動子的參與下，根據(jù)堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子挎貝。在實驗中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時由于兩條鏈之間的氫鍵被破壞也可以發(fā)生變性解鏈，當溫度降低后又可以復形成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復性，并設計引物做啟動子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。但是，DNA聚合酶在高溫時會失活，因此，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶，不但操作煩瑣，而且價格昂貴，制約了PCR技術的應用和發(fā)展。發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對于PCR的應用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環(huán)加酶，使PCR技術變得非常簡捷、同時也降低了成本，PCR技術得以大量應用，并逐步應用于臨床。常州組織RT-PCR檢測技術設計公司

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