南京分子生物學(xué)熒光PCR原理及步驟

聚合酶鏈反應(yīng)：嵌套聚合酶鏈反應(yīng):通過減少DNA非特異性擴(kuò)增的背景，提高DNA擴(kuò)增的特異性。兩組引物用于兩個(gè)連續(xù)的PCR。在個(gè)反應(yīng)中，一對(duì)引物用于產(chǎn)生DNA產(chǎn)物，除了預(yù)期的靶之外，該產(chǎn)物可能仍然由非特異性擴(kuò)增的DN段組成。然后用一組引物將產(chǎn)物用于第二次聚合酶鏈反應(yīng)，所述引物的結(jié)合位點(diǎn)完全或部分不同于次反應(yīng)中使用的每個(gè)引物，并且位于其中的3’。嵌套式PCR在特異性擴(kuò)增長(zhǎng)DN段方面通常比傳統(tǒng)PCR更成功，但它需要更詳細(xì)的目標(biāo)序列知識(shí)。重疊延伸聚合酶鏈反應(yīng)或者通過重疊延伸拼接(SOEing):一種用于將兩個(gè)或多個(gè)含有互補(bǔ)序列的DN段拼接在一起的基因工程技術(shù)。它用于連接含有基因、調(diào)節(jié)序列或突變的DN段；這項(xiàng)技術(shù)可以創(chuàng)造特定的長(zhǎng)DNA構(gòu)建體。它還可以將缺失、插入或點(diǎn)突變引入DNA序列。PCR由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。南京分子生物學(xué)熒光PCR原理及步驟

聚合酶鏈反應(yīng)注意事項(xiàng)：在實(shí)驗(yàn)過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在總RNA的提取過程中，注意避免mRNA的斷裂；為了防止非特異性擴(kuò)增，必須設(shè)陰性對(duì)照；內(nèi)參的設(shè)定：主要為了用于靶RNA的定量。常用的內(nèi)參有G3PD（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、β-Actin（β-肌動(dòng)蛋白）等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差；PCR不能進(jìn)入平臺(tái)期，出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)與所擴(kuò)增的目的基因的長(zhǎng)度、序列、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及目標(biāo)DNA起始的數(shù)量有關(guān)。故對(duì)于每一個(gè)目標(biāo)序列出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)的循環(huán)數(shù)，均應(yīng)通過單獨(dú)實(shí)驗(yàn)來確定；防止DNA的污染： 采用DNA酶處理RNA； 在可能的情況下，將PCR引物置于基因的不同外顯子，以消除基因和mRNA的共線性。南京分子生物學(xué)熒光PCR原理及步驟聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的模板的取材主要依據(jù)PCR的擴(kuò)增對(duì)象，可以是病原體標(biāo)本如病毒、細(xì)菌、菌類等。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。工具/原料：擴(kuò)增緩沖液，四種dNTP，引物，模板DNA，Taq DNA聚合酶， Mg離子，蒸餾水。模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。

聚合酶鏈反應(yīng)的常見問題分析與解決方法：擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)多條帶(雜帶)：引物用量偏大，引物的特異性不高。應(yīng)調(diào)換引物或降低引物的使用量。循環(huán)的次數(shù)過多。適當(dāng)增加模板的量，減少循環(huán)次數(shù)。酶的用量偏高或酶的質(zhì)量不好，應(yīng)降低酶量或調(diào)換另一來源的酶。退火溫度偏低，退火及延伸時(shí)間偏長(zhǎng)。應(yīng)提高退火溫度，減少變性與延伸時(shí)間，也可采用二種溫度的PCR擴(kuò)增。以2度為梯度設(shè)計(jì)梯度PCR反應(yīng)優(yōu)化退火溫度。 樣品處理不當(dāng)。Mg2+濃度偏高，因適當(dāng)調(diào)整Mg2+使用濃度。若為PCR試劑盒，也可能時(shí)試劑盒本身質(zhì)量有問題。復(fù)制提前終止。使用非熱啟動(dòng)的聚合酶時(shí)常有發(fā)生。冰上準(zhǔn)備反應(yīng)體系或采用熱啟動(dòng)聚合酶。多重連接依賴探針擴(kuò)增允許用單個(gè)引物對(duì)擴(kuò)增多個(gè)靶標(biāo)，從而避免多重PCR的分辨率限制。

現(xiàn)在有些PCR因?yàn)閿U(kuò)增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是很好也能在很短的時(shí)間內(nèi)復(fù)制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時(shí)在60℃-65℃間進(jìn)行，以減少一次升降溫過程，提高了反應(yīng)速度。檢測(cè)：PCR反應(yīng)擴(kuò)增出了高的拷貝數(shù)，下一步檢測(cè)就成了關(guān)鍵。熒光素（溴化乙錠，EB）染色凝膠電泳是很常用的檢測(cè)手段。電泳法檢測(cè)特異性是不太高的，因此引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判。但因?yàn)槠浜?jiǎn)捷易行，成為了主流檢測(cè)方法。近年來以熒光探針為的檢測(cè)方法，有逐漸取代電泳法的趨勢(shì)。PCR的很大特點(diǎn)是能將微量的DNA大幅增加。上海實(shí)時(shí)Real-time PCR供應(yīng)商

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對(duì)原則的。南京分子生物學(xué)熒光PCR原理及步驟

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見問題：陰性：需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增，對(duì)策為：選定一個(gè)好的引物合成單位。引物的濃度不但要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不夠，引物之間形成二聚體等。南京分子生物學(xué)熒光PCR原理及步驟

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