揚州特殊樣本熒光定量PCR

Real-time PCR：Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量較準(zhǔn)確，重現(xiàn)性較好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，普遍用于基因表達研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。實時熒光定量PCR的定量方法，在Real-time PCR中，模板定量有兩種策略，相對定量和定量。PCR的很大特點是能將微量的DNA大幅增加。揚州特殊樣本熒光定量PCR

Real-time PCR從用途上分可以分為定性分析和定量分析：定性分析指的是用于分析待檢測的樣本中是否存在我們想要檢測的成分，即待檢測成分有無的分析。通常，定性分析可以應(yīng)用于病毒以及病原菌的檢測，物種鑒定以及基因分型等。病毒及病原菌檢測，如SARS、H1N1病毒，都可以通過Real-time PCR的方法進行高靈敏度的檢測，定性分析樣本是否已被病毒傳播。物種鑒定如我們國家的一些檢驗檢疫機構(gòu)，想要檢測進口的牛肉制品中是否含有雞源、豬源或鴨源等成分，或者用于檢測羊奶中是否會摻有牛奶等等，可以通過Real-time PCR的方法進行檢測?；蚍中?，如啤酒型，肥胖型基因的檢測，就是Real-time PCR在基因分型方面的應(yīng)用。溫州組織Real-time PCR聚合酶鏈反應(yīng)為這些技術(shù)提供了大量的純DNA，有時是單鏈的。

Real-time PCR鏈反應(yīng)注意事項：在實驗過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在總RNA的提取過程中，注意避免mRNA的斷裂；為了防止非特異性擴增，必須設(shè)陰性對照；內(nèi)參的設(shè)定：主要為了用于靶RNA的定量。常用的內(nèi)參有G3PD（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、β-Actin（β-肌動蛋白）等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應(yīng)體系中擴增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差；PCR不能進入平臺期，出現(xiàn)平臺效應(yīng)與所擴增的目的基因的長度、序列、二級結(jié)構(gòu)以及目標(biāo)DNA起始的數(shù)量有關(guān)。故對于每一個目標(biāo)序列出現(xiàn)平臺效應(yīng)的循環(huán)數(shù)，均應(yīng)通過單獨實驗來確定；防止DNA的污染：采用DNA酶處理RNA；在可能的情況下，將PCR引物置于基因的不同外顯子，以消除基因和mRNA的共線性。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備：PCR引物設(shè)計，PCR反應(yīng)中有兩條引物，即5′端引物和3′引物。設(shè)計引物時以一條DNA單鏈為基準(zhǔn)（常以信息鏈為基準(zhǔn)），5′端引物與位于待擴增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物與位于待擴增片段3′端的一小段DNA序列互補。引物設(shè)計的基本原則：引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC很好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照。實時熒光定量PCR的定量方法，在Real-time PCR中，模板定量有兩種策略。

Real-time PCR-傳統(tǒng)定量PCR：擴增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗地高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，之后酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實現(xiàn)定量檢測目的。Real-time PCR反應(yīng)的一個主要限制是，為了產(chǎn)生其選擇性擴增的引物，需要目標(biāo)序列的先前信息。揚州特殊樣本熒光定量PCR

聚合酶鏈反應(yīng)的這種能力增強了許多方法，例如生成雜交探針用于雜交。揚州特殊樣本熒光定量PCR

Real-time PCR鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見問題：靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。假陽性：出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。引物設(shè)計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計引物。出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶：PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有：減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低Mg2+濃度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備：PCR所用的酶主要有兩種來源：Taq和Pfu，分別來自兩種不同的噬熱菌。揚州特殊樣本熒光定量PCR

上海司鼎生物科技有限公司是一家服務(wù)型類企業(yè)，積極探索行業(yè)發(fā)展，努力實現(xiàn)產(chǎn)品創(chuàng)新。公司致力于為客戶提供安全、質(zhì)量有保證的良好產(chǎn)品及服務(wù)，是一家有限責(zé)任公司（自然）企業(yè)。公司擁有專業(yè)的技術(shù)團隊，具有免疫印跡（WB)技術(shù)服務(wù)，熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)，膜片鉗電生理技術(shù)服務(wù)，在體光纖成像記錄技術(shù)服務(wù)等多項業(yè)務(wù)。司鼎生物自成立以來，一直堅持走正規(guī)化、專業(yè)化路線，得到了廣大客戶及社會各界的普遍認(rèn)可與大力支持。