廣州生物冷凍透射電子顯微鏡技術(shù)服務(wù)中心

冷凍電鏡技術(shù)中的電子斷層掃描技術(shù)與單顆粒分析法的比較：?jiǎn)晤w粒分析法：它的優(yōu)點(diǎn)：解析生物大分子的理論分辨率可達(dá)原子級(jí)；樣品受總輻射值??；對(duì)稱(chēng)顆粒的解析分辨率更高；分子量越大，結(jié)果越好；電子斷層掃描技術(shù)：優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單直接；對(duì)樣品的要求較低；常用于對(duì)細(xì)胞或者生物組織結(jié)構(gòu)的三維重構(gòu)；但是，對(duì)同一樣品位置多次拍照時(shí)，電子束對(duì)樣品的輻照損傷就會(huì)成為了比較嚴(yán)重的問(wèn)題；當(dāng)樣品旋轉(zhuǎn)角度受到電子束透過(guò)樣品厚度能力的限制。冷凍電鏡技術(shù)可以通過(guò)揭示細(xì)胞里發(fā)生的生命過(guò)程細(xì)節(jié)，幫助人們了解很多有意思的生物學(xué)現(xiàn)象。廣州生物冷凍透射電子顯微鏡技術(shù)服務(wù)中心

冷凍電鏡技術(shù)工作流程：首先是樣品制備。高純度、高濃度的蛋白樣品溶液被滴在一個(gè)特制的樣品載網(wǎng)上面。載網(wǎng)由一張布滿小孔的超薄非晶碳薄膜和金屬支撐框架組成，在表面張力的作用下，微孔上會(huì)形成一層跨孔的薄水膜。將多余溶液吸走后，把載有蛋白溶液超薄膜的載網(wǎng)迅速投入到液態(tài)乙烷冷凍劑中使其快速冷凍，從而使蛋白質(zhì)分散固定在玻璃態(tài)的冰膜中。然后電鏡圖像采集。選擇較有可能產(chǎn)生較佳圖像的較佳顆粒密度和玻璃態(tài)冰厚度的樣品。福州透射電鏡技術(shù)平臺(tái)冷凍電子顯微鏡技術(shù)步驟樣品制備注意：用于冷凍電鏡研究的生物樣品必須非常純凈。

冷凍電鏡技術(shù)原理之電子斷層掃描成像技術(shù)：通過(guò)在顯微鏡內(nèi)傾轉(zhuǎn)樣品從而收集樣品多角度的電子顯微圖像并對(duì)這些電子顯微圖像根據(jù)傾轉(zhuǎn)幾何關(guān)系進(jìn)行重構(gòu)的方法稱(chēng)為電子斷層掃描成像技術(shù)。該方法主要應(yīng)用于細(xì)胞及亞細(xì)胞器，以及沒(méi)有固定結(jié)構(gòu)的生物大分子復(fù)合物(分子量范圍為800kD)，Zgao分辨率約2nm。冷凍電鏡的分類(lèi)：目前我們討論的冷凍電鏡基本上指的都是冷凍透射電鏡，但是如果我們以使用冷凍技術(shù)的角度定義冷凍電鏡的話，冷凍電鏡主要可以分為冷凍透射電鏡、冷凍掃描電鏡、冷凍蝕刻電子顯微鏡。

冷凍電鏡技術(shù)解析結(jié)構(gòu)主要風(fēng)險(xiǎn)在：A.樣品很不穩(wěn)定，樣品寄送過(guò)來(lái)的時(shí)候，已經(jīng)降解或者聚集，無(wú)法進(jìn)行后續(xù)處理；B.樣品在冷凍制樣的過(guò)程中，可能會(huì)被凍碎，從而無(wú)法進(jìn)行后續(xù)處理；C.樣品純度可能很好，但是均一度很差，從而難以獲得樣品的高分辨結(jié)構(gòu)；D.我們關(guān)心的區(qū)域可能在整個(gè)復(fù)合體中有很強(qiáng)的柔性，從而經(jīng)過(guò)二維或者三維平均后，我們關(guān)心區(qū)域的分辨率會(huì)比較差甚至看不見(jiàn)，達(dá)不到我們的預(yù)期；E.一些配體，比如藥物前體分子，分子量太小，不一定能在電鏡的密度圖中觀測(cè)到；F.對(duì)于合適的樣品，我們冷凍制樣需要優(yōu)化的參數(shù)有很多，包括樣品濃度的優(yōu)化，blottime的優(yōu)化，溫度的優(yōu)化，grid規(guī)格（銅網(wǎng)或者金網(wǎng)）的優(yōu)化等一系列條件的優(yōu)化。因此冷凍電鏡制樣需要豐富的經(jīng)驗(yàn)和充足的機(jī)時(shí)支持，不同的實(shí)驗(yàn)者，成功率可能差別很大。冷凍電鏡技術(shù)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)：適合于研究結(jié)構(gòu)不規(guī)則的大分子復(fù)合物，對(duì)于分子量的上限沒(méi)有限制。

冷凍電鏡技術(shù)：隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步和人類(lèi)對(duì)于生命科學(xué)領(lǐng)域知識(shí)的不斷積累，藥物研發(fā)越來(lái)越走向理性化，包括法規(guī)體系的建立和優(yōu)化、藥品質(zhì)量控制模式的變遷走向QbD階段?；诮Y(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)已經(jīng)逐漸成為藥物開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)的主流，與此同時(shí)冷凍電鏡技術(shù)也在蓬勃發(fā)展。冷凍電鏡單顆粒分析技術(shù)和微晶電子衍射技術(shù)不只能解析近原子分辨率的結(jié)構(gòu)，而且能解析傳統(tǒng)結(jié)構(gòu)生物學(xué)無(wú)法解析的結(jié)構(gòu)，幫助確認(rèn)藥物靶點(diǎn)，拓展可用藥物靶點(diǎn)的研究范圍和完善基于靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)。冷凍電子斷層掃描技術(shù)在不久的未來(lái)可能提供細(xì)胞原位觀察藥物與靶點(diǎn)的作用。冷凍電鏡技術(shù)，是一種重要的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究方法。福州透射電鏡技術(shù)平臺(tái)

冷凍電子顯微鏡技術(shù)之樣品成像：低劑量輻照成像，普通樣品材料在進(jìn)行表征時(shí)，電子劑量越高成像質(zhì)量越好。廣州生物冷凍透射電子顯微鏡技術(shù)服務(wù)中心

冷凍電鏡技術(shù)工作流程：做好前面的工作就需要設(shè)定較佳的參數(shù)（比如：欠焦值、放大倍數(shù)和電子劑量等），記錄這些樣品區(qū)域的大量圖像，用手工或半自動(dòng)程序框取那些離散的分子形成的投影圖。然后就是三維結(jié)構(gòu)搭建。由于電子可能對(duì)非常敏感的樣品造成輻射損傷，所以單顆粒冷凍電鏡只能采用非常低的電子量，而這種電鏡2D投影圖像有非常大的背景噪聲。為提高圖像分辨率，研究人員首先需要提出一個(gè)初始的3D模型，然后對(duì)捕獲的單顆粒2D圖像進(jìn)行分選。廣州生物冷凍透射電子顯微鏡技術(shù)服務(wù)中心