上海實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)服務(wù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的特點(diǎn)：靈敏度高：PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12）量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克（μg=-6）水平。能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞；在病毒的檢測(cè)中，PCR的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU(空斑形成單位）；在細(xì)菌學(xué)中很小檢出率為3個(gè)細(xì)菌。簡(jiǎn)便、快速：PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴(kuò)增液和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在2～4 小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無(wú)放射性污染、易推廣。純度要求低：不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA 粗制品及RNA均可作為擴(kuò)增模板?？芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等DNA擴(kuò)增檢測(cè)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：模板的制備，PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。上海實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)服務(wù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：定量PCR允許實(shí)時(shí)定量和檢測(cè)特定的DNA序列，因?yàn)樗诤铣蛇^(guò)程中測(cè)量濃度。有兩種方法可以同時(shí)檢測(cè)和定量。種方法是使用在DNA雙鏈之間非特異性保留的熒光染料。第二種方法涉及編碼特定序列并被熒光標(biāo)記的探針。只有在探針與其互補(bǔ)DNA雜交后，才能使用這些方法檢測(cè)DNA。一種有趣的技術(shù)組合是實(shí)時(shí)PCR和逆轉(zhuǎn)錄。這種復(fù)雜的技術(shù)被稱為RT-qPCR，允許定量少量RNA。通過(guò)這種組合技術(shù)，mRNA被轉(zhuǎn)化為cDNA，并用qPCR進(jìn)一步定量。這種技術(shù)降低了聚合酶鏈反應(yīng)終點(diǎn)出錯(cuò)的可能性，增加了檢測(cè)與遺傳疾病如病癥相關(guān)的基因的機(jī)會(huì)。實(shí)驗(yàn)室使用RT-qPCR來(lái)靈敏地測(cè)量基因調(diào)控。徐州血液熒光PCR原理及步驟聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種用于放大擴(kuò)增特定的DN段的分子生物學(xué)技術(shù)。

聚合酶鏈反應(yīng)的常見(jiàn)問(wèn)題分析與解決方法：MgCl2濃度過(guò)高?？蛇m當(dāng)降低其用量。模板量過(guò)多。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)<50 ng，而基因組DNA則應(yīng)<200 ng。引物濃度不夠優(yōu)化。對(duì)引物進(jìn)行梯度稀釋重復(fù)PCR反應(yīng)。循環(huán)次數(shù)過(guò)多；增加模板量減少循環(huán)次數(shù)至30，縮短退火時(shí)間及延伸時(shí)間，或改用二種溫度的PCR循環(huán)。退火溫度過(guò)低。電泳體系有問(wèn)題：凝膠中緩沖液和電泳緩沖液濃度相差太大；凝膠沒(méi)有凝固好；瓊脂糖質(zhì)量差。若為PCR試劑盒則可能：由于運(yùn)輸儲(chǔ)存不當(dāng)引起試劑盒失效；試劑盒本身質(zhì)量有問(wèn)題，如引物選擇、循環(huán)參數(shù)等選擇不當(dāng)。降解的陳舊模板擴(kuò)增也易產(chǎn)生涂布。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種體外迅速擴(kuò)增DN段的技術(shù)，它能以極少量的DNA為模版，在幾小時(shí)內(nèi)復(fù)制出上百萬(wàn)份的DNA拷貝。DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動(dòng)子的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時(shí)由于兩條鏈之間的氫鍵被破壞也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)形成為雙鏈。因此，通過(guò)溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，并設(shè)計(jì)引物做啟動(dòng)子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。但是，DNA聚合酶在高溫時(shí)會(huì)失活，因此，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶，不但操作煩瑣，而且價(jià)格昂貴，制約了PCR技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對(duì)于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個(gè)循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡(jiǎn)捷、同時(shí)也降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用，并逐步應(yīng)用于臨床。PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)時(shí)間一般為48h以內(nèi)，有些很好于當(dāng)日電泳檢測(cè)，大于48h后帶型不規(guī)則甚至消失。

現(xiàn)在有些PCR因?yàn)閿U(kuò)增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是很好也能在很短的時(shí)間內(nèi)復(fù)制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時(shí)在60℃-65℃間進(jìn)行，以減少一次升降溫過(guò)程，提高了反應(yīng)速度。檢測(cè)：PCR反應(yīng)擴(kuò)增出了高的拷貝數(shù)，下一步檢測(cè)就成了關(guān)鍵。熒光素（溴化乙錠，EB）染色凝膠電泳是很常用的檢測(cè)手段。電泳法檢測(cè)特異性是不太高的，因此引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判。但因?yàn)槠浜?jiǎn)捷易行，成為了主流檢測(cè)方法。近年來(lái)以熒光探針為的檢測(cè)方法，有逐漸取代電泳法的趨勢(shì)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其是避免3 ′端的互補(bǔ)重疊。南京實(shí)時(shí)熒光PCR原理及步驟

許多疾病的未知病因的測(cè)序正在通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)得到解決。上海實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)服務(wù)

聚合酶鏈反應(yīng)注意事項(xiàng)：在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在總RNA的提取過(guò)程中，注意避免mRNA的斷裂；為了防止非特異性擴(kuò)增，必須設(shè)陰性對(duì)照；內(nèi)參的設(shè)定：主要為了用于靶RNA的定量。常用的內(nèi)參有G3PD（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、β-Actin（β-肌動(dòng)蛋白）等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差；PCR不能進(jìn)入平臺(tái)期，出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)與所擴(kuò)增的目的基因的長(zhǎng)度、序列、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及目標(biāo)DNA起始的數(shù)量有關(guān)。故對(duì)于每一個(gè)目標(biāo)序列出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)的循環(huán)數(shù)，均應(yīng)通過(guò)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定；防止DNA的污染： 采用DNA酶處理RNA； 在可能的情況下，將PCR引物置于基因的不同外顯子，以消除基因和mRNA的共線性。上海實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)服務(wù)