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PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)中的RT-PCR一步法和兩步法的優(yōu)缺點(diǎn)介紹：一步法：利用同一緩沖液，在同一體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、Taq酶、4種dNTP直接進(jìn)行mRNA反轉(zhuǎn)錄與PCR擴(kuò)增。發(fā)現(xiàn)Taq酶不僅具有DNA多聚酶的作用，而且具有反轉(zhuǎn)錄酶活性，可利用其雙重作用在同一體系中直接以mRNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和其后PCR擴(kuò)增，從而使mRNA的PCR步驟更為簡化。所需樣品量減少到比較低限度，臨床小樣品的檢測非常有利。用一步法擴(kuò)增可檢測出總RNA中小于1ng的低豐度mRNA.該法可用于低豐度mRNA的cDNA文庫的構(gòu)建及特異cDNA的克隆，并有可能與Taq酶的測序技術(shù)相組合，使得自動(dòng)反轉(zhuǎn)錄、基因擴(kuò)增與基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的測序在單管中進(jìn)行。兩步法：由于單管反應(yīng)時(shí)RT和PCR都不能在比較好條件下進(jìn)行并且容易相互干擾，常只適宜用基因特異引物擴(kuò)增較短的基因，及定量PCR.兩步法則是將RT和PCR分別進(jìn)行，這樣使得兩個(gè)反應(yīng)充分發(fā)揮各自的特點(diǎn)，更為靈活而且嚴(yán)謹(jǐn)，適合那些GC含量、二級結(jié)構(gòu)嚴(yán)重的模板或者是未知模板，以及多個(gè)基因的RT-PCR。pcr檢測，**常規(guī)的實(shí)驗(yàn)，英瀚斯生物給您**靠譜的結(jié)果。四川靠譜pcr檢測

PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)中的巢氏PCR（NestedPCR）介紹：巢氏PCR需要兩到三對引物，一般采用較為套引物擴(kuò)增15-30個(gè)循環(huán)，再用擴(kuò)增DNA的片段內(nèi)設(shè)定的第二套引物擴(kuò)增15-30個(gè)循環(huán)，這樣可使待擴(kuò)增序列得到高效擴(kuò)增，而次級結(jié)構(gòu)卻很少擴(kuò)增。套式引物PCR減少了引物非特異性退火，從而增加了特異性擴(kuò)增，提高了擴(kuò)增效率。若將套失PCR的內(nèi)外引物稍加改變，延長外引物長度（25-30bp），同時(shí)縮短內(nèi)引物長度（15-17bp），使外引物先在高退火溫度下復(fù)性，做雙溫?cái)U(kuò)增，然后改換至三溫循環(huán)，使內(nèi)引物在外引物擴(kuò)增的基礎(chǔ)上，在低退火溫度復(fù)性，直到擴(kuò)增完成，這樣就可以使兩套引物一次同時(shí)加入。河北常見pcr外包哪些公司可以做pcr檢測？

PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)中的快速PCR（FastPCR）介紹：在快速PCR中，通過縮減PCR步驟所需的時(shí)間來完成更快的擴(kuò)增，而不影響擴(kuò)增產(chǎn)量和效率。快速循環(huán)條件尤其適用于均有高擴(kuò)增能力的DNA聚合酶，這種聚合酶在每次結(jié)合中可引入更多的核苷酸。高擴(kuò)增能力的聚合酶可保持高擴(kuò)增效率，而PCR延伸時(shí)間是Taq聚合酶（低擴(kuò)增能力）延伸時(shí)間的1/2到1/3（圖4）。通過將引物退火和延伸（如果溫度只相差幾度）合并成一步，PCR反應(yīng)時(shí)間可進(jìn)一步縮短。這個(gè)方案也被稱為兩步PCR方案。

PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)中的熱啟動(dòng)PCR介紹：熱啟動(dòng)PCR是除了好的引物設(shè)計(jì)之外，提高PCR特異性的重要的方法之一。盡管TaqDNA聚合酶的比較好延伸溫度在72℃，聚合酶在室溫仍然有活性。因此，在進(jìn)行PCR反應(yīng)配制過程中，以及在熱循環(huán)剛開始，保溫溫度低于退火溫度時(shí)會(huì)產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成，就會(huì)被有效擴(kuò)增。在用于引物設(shè)計(jì)的位點(diǎn)因?yàn)檫z傳元件的定位而受限時(shí)，如site-directed突變、表達(dá)克隆或用于DNA工程的遺傳元件的構(gòu)建和操作，熱啟動(dòng)PCR尤為有效。RTpcr和pcr的區(qū)別是什么？

長片段PCR通常指擴(kuò)增大于5kb的DNA的片段。長片段PCR傳統(tǒng)上使用TaqDNA聚合酶（為了快速延伸）和高保真酶（為了準(zhǔn)確度）的混合物。隨著高合成能力、高保真DNA聚合酶的發(fā)明，長片段PCR現(xiàn)在可在短時(shí)間內(nèi)高準(zhǔn)確性的完成。通過與一個(gè)強(qiáng)DNA結(jié)合蛋白的結(jié)合，聚合酶可獲得高擴(kuò)增能力，可在短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增長片段（如>20kbgDNA的片段）。初次之外，極高保真度（如>100xTaq）可確保長片段擴(kuò)增的低錯(cuò)誤率。當(dāng)擴(kuò)增>10kb的片段時(shí)，PCR實(shí)驗(yàn)方案可能需要在以下5個(gè)關(guān)鍵位置進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化：確保使用高質(zhì)量、高純度的DNA樣本。如果DNA聚合酶的熱穩(wěn)定較低，使用更多量的DNA聚合酶以彌補(bǔ)多次循環(huán)中的聚合酶活性損失。降低退火和延伸步驟的溫度，以助于引物結(jié)合。適當(dāng)增加PCR步驟的時(shí)間，以促進(jìn)模板DNA的完全分離及引物的結(jié)合。適當(dāng)增加PCR延伸時(shí)間確保目的片段的全長擴(kuò)增。英瀚斯生物，專業(yè)分子檢測平臺，高質(zhì)量pcr檢測。四川推薦pcr擴(kuò)增

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PCR是一種具有選擇性的體外擴(kuò)增DNA的片段的方法。其特異性由兩個(gè)人工合成的引物DNA序列決定。所謂引物是指與待擴(kuò)增核酸片段兩端互補(bǔ)的寡核苷酸，其本質(zhì)是ssDNA(單鏈DNA)的片段。指在引物指導(dǎo)下由酶催化的對特定模板（克隆或基因組DNA）的擴(kuò)增反應(yīng)，是模擬體內(nèi)DNA復(fù)制過程，在體外特異性擴(kuò)增基因片段的一種技術(shù)，在分子生物學(xué)中有普遍的應(yīng)用，包括用于DNA作圖、DNA測序、分子系統(tǒng)遺傳學(xué)等。CR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則復(fù)制成同樣的兩分子拷貝。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時(shí)也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，加入設(shè)計(jì)引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。四川靠譜pcr檢測

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