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細胞培養(yǎng)后，需要對其生長情況、形態(tài)甚至生物學性狀進行觀察。由于細胞小而復雜，若不借助適當?shù)氖侄危y以觀察其形態(tài)、結構，更難發(fā)現(xiàn)細胞內各種組分的分子組成及功能。目前，已有多種研究細胞的技術，從光學顯微鏡到電子顯微鏡，從一般細胞化學法到免疫化學法。細胞染色是研究細胞生物學特征的一種常用手段，然而，對于細胞實驗新手來說，想要獲得一張漂亮的細胞染色圖并不容易。染色試劑不會選、細胞染色不均勻、染色時切片脫落等都是很常見的問題。

細胞膜常用染料DiD、DiR、DiO和DiI染料是最常見的細胞膜染料（見表2），它們是一族親脂性的熒光染料，用于細胞的形態(tài)學和結構研究。該系列染料進入細胞膜后，會在整個細胞膜上側向擴散，在比較好濃度時可以使整個細胞膜染色。其中DiD染料的染色效率高，染色均一，熒光不易猝滅，無明顯細胞毒性，且受自身熒光背景干擾小。目前DiD已成功應用于多種細胞的體內示蹤研究，如Treg細胞、間充質干細胞、腫瘤細胞、造血干祖細胞等。 熒光染料，由于靈敏度高，操作方便，逐漸取代了放射性同位素作為檢測標記，其應用于熒光探針，細胞染色等。大連熒光染料DIR

選擇熒光染料時要考慮那些因素：激發(fā)波長處的消光系數(shù)應盡可能高：消光系數(shù)是衡量可以吸收多少光子的量度。量子產率應該盡可能高：這是吸收光子與發(fā)射光子的比率。消光系數(shù)和量子產率的乘積就是亮度。熒光染料應該是光穩(wěn)定的：遺憾的是，比較不同公司染料的光穩(wěn)定性的研究并不多。光致變色行為：對于STORM實驗，您需要一個閃爍的熒光團。但是，對于分子跟蹤實驗，您***不想要閃爍的熒光團?；?死細胞滲透性。您想要的反應側基（例如HaloTag、抗體等）。當您使用多個熒光探針時，尤其是當您量化共定位時，請謹慎處理其他顏色通道中的滲色。單獨測試所有熒光探針以評估滲透。新疆化合物熒光染料吲哚菁綠（Indocyanine Green，簡稱ICG）是一種廣泛應用于醫(yī)學和生物領域的熒光染料。

染料DiI, DiO, DiD 和 DiR是一類親脂性熒光染料家族，用于標記細胞膜和疏水性組織。這是一類環(huán)境敏感型熒光染料，當它們與膜結合或者與親脂性生物分子(例如蛋白質，雖然在水中其熒光強度很弱)結合時，其熒光強度***增強。它們具有很高的淬滅系數(shù)，偏光依賴性和很短的激發(fā)壽命。一旦應用于細胞中，這種染料會在細胞內質膜中逐步擴散，導致在其比較好濃度條件下，將整個細胞染色。它們不同的熒光顏色：DiI（橙色熒光）、DiO（綠色熒光）、DiD（紅色熒光）、DiR（深紅色熒光），為活細胞多色彩熒光成像分析和流式細胞術提供了一種便捷的工具。DiO和DiI可以分別與標準的FITC和TRITC濾光器一同使用。其中，DiO可以被633 nm He-Ne激光激發(fā)，并且具有比DiI更長的激發(fā)和發(fā)射光波長，為標記細胞和組織的那些本身就具有本底熒光的染料提供了非常***的替代品。DiR在***成像或者示蹤中非常有用，因為它們所發(fā)射的紅外光可以高效地穿過細胞和組織，并且在紅外光范圍內，其本底熒光水平很低。

FITC熒光標記蛋白的應用及特點:活性熒光染料，如FITC、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)、羅丹明B(RhodamineB)或AlexaFluor染料，可用于標記抗體或蛋白質功能基團，生成分子探針，并通過熒光成像進行檢測。當用熒光染料化學標記特異性抗體或其他純化生物分子時，它們成為用于檢測靶抗原或相互作用配偶體的熒光探針，用于細胞成像、流式細胞手術、蛋白質痕跡和酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)。由于熒光標記物具有無放射物污染、操作簡單等優(yōu)點，在蛋白質功能研究、藥物篩選等許多研究領域得到了越來越廣泛的應用。

南京星葉生物科技有限公司Super Fluor 系列（效果同Alexa Fluor系列）

且Super Fluor活化酯（與Invitrogen的Alexa Fluor活化酯完全相同） Cy5.5含有一個游離胺基,可與多種官能團共軛,包括NHS酯和環(huán)氧化合物。

三、流式細胞儀分析1、取對數(shù)生長期的細胞，接種到孔板，過夜培養(yǎng)。2、如果要進行藥物刺激，在細胞中加入感興趣的藥物進行干預，繼續(xù)培養(yǎng)一定時間后，收集細胞，PBS清洗2次。3、加入Rhodamine123工作液重懸細胞，37℃避光孵育15min或更長時間?！咀⒁狻浚河捎诩毎N類和實驗體系不同，Rhodamine123工作液濃度和孵育時間可以根據預實驗或參考文獻自行調整。4、用流式細胞儀檢測。

四、實驗案例1、取對數(shù)生長期A549細胞接于六孔板（1*106+2mlDMEM培養(yǎng)基）,37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4-24h待其貼壁，以便后續(xù)實驗操作.2、棄掉培養(yǎng)液，PBS洗滌兩次.3、用培養(yǎng)基（無血清）稀釋Rh123母液制備1～20μMRh123工作液。具體工作濃度取決于細胞類型和細胞濃度。4、將Rh123工作液加入六孔板并在37℃下孵育30分鐘.5、去除Rh123工作液并用PBS洗滌三次細胞去除背景色.6、熒光顯微鏡觀察. Cy3染料的激發(fā)峰和發(fā)射峰分別在550 nm和570 nm左右。廣西熒光染料IR780

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熒光染料，由于靈敏度高，操作方便，逐漸取代了放射性同位素作為檢測標記，其廣泛應用于熒光免疫，熒光探針，細胞染色等。包括特異性的DNA染色，用于染色體分析、細胞周期、細胞凋亡等相關研究。另有很多核酸染料在多色染色系統(tǒng)中是非常有用的復染劑，可作為背景對照，標記細胞核使細胞內結構的空間關系一目了然。熒光標記的單克隆抗體技術為流式細胞儀在研究細胞膜和細胞內各種功能性抗原、**基因蛋白等領域擴展了無限的應用空間。熒光探針可以通過蛋白質交聯(lián)劑共價結合在單克隆抗體上。免疫熒光標記**常用的染料有異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)、藻紅蛋白(PE)以及AlexaFluor系列染料等。核酸熒光染料對細胞核染色后定量測量細胞所發(fā)出的熒光強度，就可以確定細胞核中DNA、RNA的含量，并可以對細胞周期和細胞的增殖狀況進行分析。有多種熒光染料可以對細胞中的DNA或RNA染色，常用的DNA染料包括碘化丙啶(PI)、DAPI、Hoechst33342等，RNA染料有噻唑橙、吖啶橙等。大連熒光染料DIR