熒光的猝滅：熒光分子的輻射能力在受到激發(fā)光較長時(shí)間的照射后會(huì)減弱甚至猝滅，這是由于激發(fā)態(tài)分子的電子不能回復(fù)到基態(tài)，所吸收的能量無法以熒光的形式發(fā)射。一些化合物有天然的熒光猝滅作用而被用作猝滅劑，以消除不需用的熒光。因此熒光物質(zhì)的保存應(yīng)注意避免光（特別是紫外光）的直接照射和與其他化合物的接觸。在熒光抗體技術(shù)中常用一些非熒的色素物質(zhì)如亞甲藍(lán)、堿性復(fù)紅。伊文思藍(lán)或低濃度的過錳酸鉀、碘溶液等對(duì)標(biāo)本進(jìn)行得當(dāng)復(fù)染，以減弱非特異性熒光本質(zhì)，使特異熒光更突出顯示。熒光抗體技術(shù)可用于檢測和定位各種抗原，也可以用于檢測和定位抗體。TNFa免疫熒光檢查細(xì)胞的固定及免疫熒光：注意事項(xiàng)：（1）取細(xì)胞爬片時(shí)，動(dòng)作應(yīng)輕柔，...

熒光效率：熒光分子不會(huì)將全部吸收的光能都轉(zhuǎn)變成熒光，總或多或少地以其他形式釋放。熒光效率是指熒光分子將吸收的光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率，與發(fā)射熒光光量子的數(shù)值成正比。熒光效率＝發(fā)射熒光的光量分子數(shù)（熒光強(qiáng)度）／吸收光的光量子數(shù)（激發(fā)光強(qiáng)度）。發(fā)射熒光的光量子數(shù)亦即熒光強(qiáng)度，除受激發(fā)光強(qiáng)度影響外，也與激發(fā)光的波長有關(guān)。各個(gè)熒光分子有其特定的吸收光譜和發(fā)射光譜（熒光光譜），即在某一特定波長處有較大吸收峰和較大發(fā)射峰。選擇激發(fā)光波長量接近于熒光分子的較大吸收峰波長，且測定光波量接近于較大發(fā)射光波峰時(shí)，得到的熒光強(qiáng)度也較大。在1941年，Coons初次成功地使用熒光素作為標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)。公司免疫...

細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)常見問題:1、信號(hào)弱或者無信號(hào)：細(xì)胞或組織樣本保存時(shí)間過長；2）抗體濃度不合適，參照抗體說明書的稀釋濃度，再根據(jù)樣本表達(dá)量進(jìn)行摸索；3）一抗孵育時(shí)間不合適，建議 4 ℃ 過夜孵育。2、高背景：封閉不充分；抗體濃度過高；抗體孵育時(shí)間過長或溫度過高；清洗不充分；樣本變干，染色過程確保樣品始終浸沒于液體環(huán)境中.3、非特異性染色較多：固定液殘留，這里需要縮短固定時(shí)間并且在封閉液中加甘氨酸，并且抗原修復(fù)也可以幫助解決非特異性染色；二抗殘留，二抗需要用帶有吐溫 20 的 PBS 溶解，只要熒光顯微鏡的強(qiáng)度還可以增大，那么就可以增加吐溫洗脫掉非特異性染色。免疫熒光技術(shù)可以用于研究代謝疾病和內(nèi)...

免疫熒光的原理和類型：免疫熒光利用熒光分子或熒光團(tuán)在一定波長（分子的吸收光譜）下吸收光子的特性，經(jīng)過短暫的間隔（發(fā)射光譜）后以較高的波長發(fā)射光子，并伴隨能量損失。發(fā)射的熒光可通過顯微鏡觀察到。熒光團(tuán)可以通過可見光或紫外光激發(fā)。具有高光穩(wěn)定性和熒光量子產(chǎn)率的熒光染料可在市場上購買，其激發(fā)較大值跨越從400到>700nm的波長范圍。它們不會(huì)損傷活細(xì)胞，可安全用于生物制劑。在進(jìn)行免疫熒光檢測時(shí)，首先對(duì)細(xì)胞或組織進(jìn)行固定和透化處理。進(jìn)行免疫染色時(shí)，熒光團(tuán)與目標(biāo)抗原的抗體結(jié)合，然后使用成像顯微鏡觀察熒光信號(hào)。根據(jù)使用的抗體和所需的信號(hào)擴(kuò)增，免疫熒光可分為直接和間接兩種類型。免疫熒光技術(shù)在生物學(xué)研究、醫(yī)學(xué)...

熒光物質(zhì)，熒光色素：許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機(jī)化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有：⑴異硫氰酸熒光素為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，較大吸收光波長為490--495nm，較大發(fā)射光波長520--530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，結(jié)構(gòu)式如下：有兩種同分異結(jié)構(gòu)，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年，是應(yīng)用較普遍的熒光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是：①人眼對(duì)黃綠色較為敏感，②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。⑵四乙基羅丹明為橘紅色粉末，不溶于水，易...

細(xì)胞免疫熒光可以觀察蛋白在細(xì)胞中的定位，以及一些特殊信號(hào)分子蛋白的出核/入核的定位變化。在進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光過程中，需要用到細(xì)胞爬片，通過將爬片浸在細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)，細(xì)胞在爬片上生長，進(jìn)而進(jìn)行細(xì)胞的免疫熒光。實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：1.胰酶;2.DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基;3.細(xì)胞培養(yǎng)12孔板或者6孔板;4.爬片。間接免疫熒光的優(yōu)點(diǎn)：通過增加能夠與一抗結(jié)合的二抗數(shù)量進(jìn)行信號(hào)放大；與直接免疫熒光相比，通過信號(hào)放大提高檢測靈敏度。免疫熒光技術(shù)是一種以熒光素標(biāo)記抗體來定位抗原物質(zhì)的高度發(fā)達(dá)的標(biāo)記免疫技術(shù)。免疫熒光技術(shù)是基于免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的重要方法之一。F4/80免疫熒光試驗(yàn)免疫熒光間接法測抗體實(shí)驗(yàn)步驟：滴加0....

免疫熒光通透（目的是使抗體進(jìn)入胞內(nèi)），0.5%TritonX-100(一種去垢劑，用PBS配制)室溫通透20min（針對(duì)胞內(nèi)抗原，若是細(xì)胞膜上表達(dá)的抗原則省略該步驟）；除了TritonX-100，也可作為通透劑，并且固定后的樣品不需要通透。封閉（減少一抗和二抗與非特異位點(diǎn)進(jìn)行結(jié)合），通透后用PBS浸洗玻片3次，每次3min，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加山羊血清，室溫封閉30min。常用的封閉液包括：與二抗同一來源的血清、BSA或者是羊血清。從封閉開始所有的步驟，一定要注意樣品的保濕，避免樣品的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。醛類固定的樣品，在用一抗孵育前用含0.3M甘氨酸的封閉液進(jìn)行封閉。熒光...

免疫熒光-實(shí)驗(yàn)步驟：細(xì)胞爬片免疫熒光：在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的玻片用PBS浸洗3次,每次5min;（圓蓋片：13mm24孔；18mm12孔；20mm6孔）用4%的多聚甲醛固定爬片15min,PBS浸洗玻片3次,每次5min0.5%TritonX-100(PBS配制)室溫通透20min(細(xì)胞膜上表達(dá)的抗原省略此步驟);PBS浸洗玻片3次,每次3min,吸水紙吸干PBS,在玻片上滴加3%的BSA（PBS配置）,室溫封閉30min5,吸水紙吸掉封閉液,不洗,每張玻片滴加足夠量用PBS稀釋好的一抗并放入濕盒,4℃孵育過夜。加熒光二抗:PBS浸洗爬片3次,每次5min,吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋...

細(xì)胞免疫熒光可以觀察蛋白在細(xì)胞中的定位，以及一些特殊信號(hào)分子蛋白的出核/入核的定位變化。在進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光過程中，需要用到細(xì)胞爬片，通過將爬片浸在細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)，細(xì)胞在爬片上生長，進(jìn)而進(jìn)行細(xì)胞的免疫熒光。實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：1.胰酶;2.DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基;3.細(xì)胞培養(yǎng)12孔板或者6孔板;4.爬片。間接免疫熒光的優(yōu)點(diǎn)：通過增加能夠與一抗結(jié)合的二抗數(shù)量進(jìn)行信號(hào)放大；與直接免疫熒光相比，通過信號(hào)放大提高檢測靈敏度。免疫熒光技術(shù)是一種以熒光素標(biāo)記抗體來定位抗原物質(zhì)的高度發(fā)達(dá)的標(biāo)記免疫技術(shù)。免疫熒光技術(shù)可以用于研究食品安全和生物安全。COL-1免疫檢測熒光的產(chǎn)生：一此化學(xué)物質(zhì)能從外界吸收并儲(chǔ)存能量（如光能、化學(xué)...

免疫熒光固定（防止離體組織自溶抗原擴(kuò)散），固定液包括：有機(jī)溶劑（甲醇、乙醇等）；交聯(lián)劑（4%PFA、10%中性福爾馬林），固定液的選擇取決于被研究抗原的性質(zhì)及所用抗體的特性，不過，目前甲醛用的還是較多的，但針對(duì)磷酸化的抗體，不適合用甲醛，會(huì)導(dǎo)致磷酸蛋白從膜表面轉(zhuǎn)移到胞漿中，故應(yīng)選擇冰冷的無水甲醇或無水乙醇，同時(shí)應(yīng)注意甲醛會(huì)揮發(fā)，在4-8°C不宜儲(chǔ)存太久。固定時(shí)間：取決于組合塊的大小和類型，對(duì)于大多數(shù)組織，18-24h較為理想，細(xì)胞固定時(shí)間較短，一般2%的甲醛室溫固定20min即可。以細(xì)胞樣品為例：用4%的多聚甲醛固定爬片15min，PBS浸洗玻片3次，每次3min。免疫熒光技術(shù)可以用于研究肉瘤...

細(xì)胞免疫熒光步驟是什么呢？步驟：1. 細(xì)胞一定要貼在玻片上（較好可以放入24孔板），為后面照像打基礎(chǔ)。細(xì)胞密度適中，大約60-75%滿片即可，否則容易脫片。2. 取出細(xì)胞后用4%多聚甲醛固定15分鐘，現(xiàn)用現(xiàn)配。（以下各步驟切毋使玻片干燥）3. PBS沖洗；4. 0.1%Triton作用20分鐘；5. PBS沖洗；6. 10%正常血清封閉10分鐘；7. 加入一抗，4度孵育過夜（找個(gè)小瓶蓋將小玻片支起來，抗體就不容易溢出），還要記住“砸片”，就是抗體從較高處落到片子上，以分布均勻?？贵w稀釋度1：60，較常用！8. PBS沖洗4次，各5分鐘；9加入熒光二抗，室溫30分鐘?？贵w稀釋度1：400，較常用...

免疫熒光檢測相對(duì)于酶檢測的優(yōu)勢：定量熒光信號(hào)的能力（與使用基于酶的方法進(jìn)行的定性測定相反）；復(fù)用能力（可以結(jié)合不同發(fā)射光譜的熒光染料來檢測多種蛋白質(zhì)）；熒光染料的光穩(wěn)定性。免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在組織或細(xì)胞內(nèi)形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受外來激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光（黃綠色或橘紅色），可以看見熒光所在的組織細(xì)胞，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測定含量。熒光抗體標(biāo)記使得抗原定位變得可視化，有助于觀察...

細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：非特異性染色：是否滅活內(nèi)源性過氧化物酶；孵育過程中干片；抗原熱修復(fù)過度。染色過深：一抗?jié)舛冗^高；染色試濃度過高或孵育時(shí)間過長；染色劑濃度過高或孵育時(shí)間過長。通常實(shí)驗(yàn)室先固定細(xì)胞再進(jìn)行通透，但若檢測抗原是水不溶性蛋白，可先通透再固定，這樣可以通過通透去除一些水溶性蛋白，進(jìn)而可降低免疫熒光背景和非特異性信號(hào)；建議設(shè)陰性對(duì)照組，消除由于抗體非特異性結(jié)合而產(chǎn)生的背景染色；選擇醛類固定液時(shí)，保持其新鮮度，較好現(xiàn)配現(xiàn)用，使用不新鮮的醛類固定液自發(fā)熒光背景會(huì)升高。熒光抗體技術(shù)可以用于檢測和定位細(xì)胞或組織中的特定抗原物質(zhì)。COL-1免疫熒光IF熒光標(biāo)記二抗的選擇普遍；與使用熒光素結(jié)合...

細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：非特異性染色：是否滅活內(nèi)源性過氧化物酶；孵育過程中干片；抗原熱修復(fù)過度。染色過深：一抗?jié)舛冗^高；染色試濃度過高或孵育時(shí)間過長；染色劑濃度過高或孵育時(shí)間過長。通常實(shí)驗(yàn)室先固定細(xì)胞再進(jìn)行通透，但若檢測抗原是水不溶性蛋白，可先通透再固定，這樣可以通過通透去除一些水溶性蛋白，進(jìn)而可降低免疫熒光背景和非特異性信號(hào)；建議設(shè)陰性對(duì)照組，消除由于抗體非特異性結(jié)合而產(chǎn)生的背景染色；選擇醛類固定液時(shí)，保持其新鮮度，較好現(xiàn)配現(xiàn)用，使用不新鮮的醛類固定液自發(fā)熒光背景會(huì)升高。免疫熒光技術(shù)可以用于研究神經(jīng)系統(tǒng)的功能和疾病。PDX-1免疫熒光分析免疫熒光Coons等于1941年初次采用熒光素進(jìn)行標(biāo)...

免疫熒光通過抗體與示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)，進(jìn)而對(duì)抗原所在的細(xì)胞或組織進(jìn)行定性或定量。由于熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光，可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，利用定量技術(shù)測定含量，從而可對(duì)抗原進(jìn)行細(xì)胞定性和定位分析。細(xì)胞免疫熒光用途：快速直觀顯示所檢測蛋白的細(xì)胞定位。材料與儀器：樣品：貼壁細(xì)胞；試劑：4% 組織固定液，PBS，Triton X-100，BSA，熒光二抗，免疫熒光染色二抗稀釋液，抗熒光猝滅封片液，0.25% 胰酶；器材：6/12/24 孔板，細(xì)胞爬片（蓋玻片），載玻片，15 ml 離心管。免疫熒光技術(shù)可以用于研究藥物的靶點(diǎn)和作用機(jī)...

免疫熒光固定（防止離體組織自溶抗原擴(kuò)散），固定液包括：有機(jī)溶劑（甲醇、乙醇等）；交聯(lián)劑（4%PFA、10%中性福爾馬林），固定液的選擇取決于被研究抗原的性質(zhì)及所用抗體的特性，不過，目前甲醛用的還是較多的，但針對(duì)磷酸化的抗體，不適合用甲醛，會(huì)導(dǎo)致磷酸蛋白從膜表面轉(zhuǎn)移到胞漿中，故應(yīng)選擇冰冷的無水甲醇或無水乙醇，同時(shí)應(yīng)注意甲醛會(huì)揮發(fā)，在4-8°C不宜儲(chǔ)存太久。固定時(shí)間：取決于組合塊的大小和類型，對(duì)于大多數(shù)組織，18-24h較為理想，細(xì)胞固定時(shí)間較短，一般2%的甲醛室溫固定20min即可。以細(xì)胞樣品為例：用4%的多聚甲醛固定爬片15min，PBS浸洗玻片3次，每次3min。免疫熒光技術(shù)是將抗體與熒光素...

細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：非特異性染色：是否滅活內(nèi)源性過氧化物酶；孵育過程中干片；抗原熱修復(fù)過度。染色過深：一抗?jié)舛冗^高；染色試濃度過高或孵育時(shí)間過長；染色劑濃度過高或孵育時(shí)間過長。通常實(shí)驗(yàn)室先固定細(xì)胞再進(jìn)行通透，但若檢測抗原是水不溶性蛋白，可先通透再固定，這樣可以通過通透去除一些水溶性蛋白，進(jìn)而可降低免疫熒光背景和非特異性信號(hào)；建議設(shè)陰性對(duì)照組，消除由于抗體非特異性結(jié)合而產(chǎn)生的背景染色；選擇醛類固定液時(shí)，保持其新鮮度，較好現(xiàn)配現(xiàn)用，使用不新鮮的醛類固定液自發(fā)熒光背景會(huì)升高。免疫熒光技術(shù)可以用于研究肉瘤的發(fā)生和發(fā)展過程。PD-1免疫組化基于熒光成像的技術(shù)對(duì)于查詢細(xì)胞和組織的結(jié)構(gòu)和功能方面非常有...

注意:從加熒光二抗起,后面所有操作步驟都盡量在較暗處進(jìn)行.DAPI復(fù)染核:爬片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。封片：爬片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。玻片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。鏡檢拍照：切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。（DAPI紫外激發(fā)波長330-380nm，發(fā)射波長420nm，發(fā)藍(lán)光；FITC激發(fā)波長465-495nm，發(fā)射波長515-555nm，發(fā)綠光；CY3激發(fā)波長510-560，發(fā)射波長590nm，發(fā)紅光）。兩種抗體同時(shí)孵育：由于FIT容易萃滅，...

細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：1、建議細(xì)胞直接種孔板，采用倒置熒光顯微鏡拍照，這樣可以避免然后挑片時(shí)造成劃片或細(xì)胞片破損以及然后封片可能造成滑片等結(jié)果；2、若實(shí)驗(yàn)室只有正置熒光顯微鏡，則需要將細(xì)胞植于細(xì)胞爬片。建議直接購買處理過的細(xì)胞爬片；若只有普通細(xì)胞爬片，可以先將爬片于濃酸（濃酸腐蝕性強(qiáng)，注意操作）或 75% 乙醇浸泡過夜，若用酸浸泡過夜，第二天先用自來水小心沖洗掉爬片殘留的酸液，若用 75% 乙醇浸泡，則不需要此步驟。然后，用洗潔精搓洗爬片，然后用去離子水清洗爬片。置于烘箱 80 ℃ 烘干，再將爬片置于超凈臺(tái)造紫外消毒后備用。早期的免疫熒光技術(shù)是將抗體與示蹤物質(zhì)結(jié)合，用于定位組織或細(xì)胞內(nèi)的抗...

細(xì)胞免疫熒光：細(xì)胞種板與細(xì)胞爬片制備：1) 細(xì)胞密度在90%-95%左右，用預(yù)熱胰酶消化細(xì)胞后重懸細(xì)胞于完全培養(yǎng)基中，充分吹打，使之成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)。2)取細(xì)胞培養(yǎng)12孔板，在每個(gè)孔放爬片的位置根據(jù)爬片的大小，先在每個(gè)孔里準(zhǔn)備放爬片的位置滴幾滴培養(yǎng)基，然后將爬片置于液滴上，壓緊，使爬片與培養(yǎng)皿靠培養(yǎng)基的張力粘合到一起，防止加細(xì)胞懸液時(shí)爬片漂起，造成雙層細(xì)胞貼片。根據(jù)自己的需要選擇合適的細(xì)胞密度種入12孔板培養(yǎng)板內(nèi)。3)24h或者48h后，根據(jù)細(xì)胞生長速度快慢，觀察判斷細(xì)胞密度，約90%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光。免疫熒光技術(shù)可以用于研究肉瘤的發(fā)生和發(fā)展過程。P62免疫熒光檢查免疫熒光固定（防止離體組...

通過不同顏色熒光標(biāo)記不同的靶標(biāo)，可以直觀的觀察同一樣品細(xì)胞內(nèi)不同結(jié)構(gòu)和蛋白。熒光標(biāo)記靶標(biāo)的方法主要包括熒光染料、免疫標(biāo)記、熒光融合蛋白等——這幾種方法均可選擇性標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)和蛋白，讓您在成像時(shí)更輕松地進(jìn)行觀察。細(xì)胞生物學(xué)采用的很多熒光工具基本上都是熒光基團(tuán)。這些熒光基團(tuán)經(jīng)過不同的方法修飾或結(jié)合到不同的分子上，從而具備了某些的功能與特定的細(xì)胞器或蛋白結(jié)合。通過化學(xué)修飾，單個(gè)熒光基團(tuán)可以產(chǎn)生許多變體形式，且每種變體都有不同的特異性。免疫熒光技術(shù)具有高靈敏度和高特異性，可以檢測非常低濃度的目標(biāo)分子。CD31免疫熒光細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：1、建議細(xì)胞直接種孔板，采用倒置熒光顯微鏡拍照，這樣可以...

熒光物質(zhì)，熒光色素：許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機(jī)化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有：⑴異硫氰酸熒光素為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，較大吸收光波長為490--495nm，較大發(fā)射光波長520--530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，結(jié)構(gòu)式如下：有兩種同分異結(jié)構(gòu)，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年，是應(yīng)用較普遍的熒光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是：①人眼對(duì)黃綠色較為敏感，②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。⑵四乙基羅丹明為橘紅色粉末，不溶于水，易...

細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：根據(jù)所檢測抗原所在位置來確認(rèn)是否需要加入 Triton 進(jìn)行通透。若所檢測抗原表位位于膜蛋白的白外段，則不需要通透；一般 5% BSA 封閉即可達(dá)到效果；從加熒光二抗起，后面所有操作步驟盡量避光?？s短在熒光顯微鏡下的觀察時(shí)間，1~2 h 為宜。染色后盡快熒光顯微鏡下觀察，若不能可放入 4 ℃ 冰箱避光保存一周。無/弱染色：烤片溫度過高，推薦 56~60 ℃ 1~2 h；一抗是否適用固定液和石蠟切片，使用濃度是否過低，孵育是否時(shí)間過短等。在1941年，Coons初次成功地使用熒光素作為標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)。BMP2免疫熒光染色細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)常見問題:1、信號(hào)弱或者...

免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù)。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。免疫熒光技術(shù)是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種．它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù)。Coons等于1941年初次采用熒光素進(jìn)行標(biāo)記抗體獲得成功。經(jīng)過幾十年的發(fā)展，該技術(shù)已相當(dāng)成熟。用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù)。在實(shí)際工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用，所...

免疫熒光應(yīng)用范圍：其應(yīng)用范圍極其普遍，可以測定內(nèi)分泌、蛋白質(zhì)、多肽、核酸、神經(jīng)遞質(zhì)、受體、細(xì)胞因子、細(xì)胞表面抗原、肉瘤標(biāo)志物、血藥濃度等各種生物活性物質(zhì)。根據(jù)診斷類別，又可分為傳染性疾病、內(nèi)分泌、藥物檢測、免疫學(xué)、血型鑒定等。許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機(jī)化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。異硫氰酸熒光素為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，較大吸收光波長為490495nm，較大發(fā)射光波長520530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。免疫熒光技術(shù)可以用于研究神經(jīng)系統(tǒng)的功能和疾病。IL-10免疫熒光染色免疫...

其他熒光物質(zhì)：1．酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無熒光效應(yīng)，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強(qiáng)熒光的物質(zhì)。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發(fā)出熒光，激發(fā)光波長為360nm，發(fā)射光波長為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對(duì)羥基乙酸等。2．鑭系螯合物某些3價(jià)稀土鑭系元素如銪（Eu3+）、鋱（Tb3+）、鈰（Ce3+）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光，其中以Eu3+應(yīng)用較廣。Eu3+螯合物的激發(fā)光波長范圍寬，發(fā)射光波長范圍窄，熒光衰變時(shí)間長，較適合用于分辨熒光免疫測定。所需要的儀器：熒光顯微鏡、顯微熒光分光光度計(jì)...

免疫熒光固定（防止離體組織自溶抗原擴(kuò)散），固定液包括：有機(jī)溶劑（甲醇、乙醇等）；交聯(lián)劑（4%PFA、10%中性福爾馬林），固定液的選擇取決于被研究抗原的性質(zhì)及所用抗體的特性，不過，目前甲醛用的還是較多的，但針對(duì)磷酸化的抗體，不適合用甲醛，會(huì)導(dǎo)致磷酸蛋白從膜表面轉(zhuǎn)移到胞漿中，故應(yīng)選擇冰冷的無水甲醇或無水乙醇，同時(shí)應(yīng)注意甲醛會(huì)揮發(fā)，在4-8°C不宜儲(chǔ)存太久。固定時(shí)間：取決于組合塊的大小和類型，對(duì)于大多數(shù)組織，18-24h較為理想，細(xì)胞固定時(shí)間較短，一般2%的甲醛室溫固定20min即可。以細(xì)胞樣品為例：用4%的多聚甲醛固定爬片15min，PBS浸洗玻片3次，每次3min。熒光抗體技術(shù)可用于檢測和定位...

細(xì)胞和組織樣品處理：準(zhǔn)備熒光標(biāo)記的細(xì)胞樣品：為實(shí)現(xiàn)較佳的圖像質(zhì)量，首先應(yīng)建立針對(duì)目的蛋白和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的研究，同時(shí)將其他一切背景等排除在圖像之外。固定和破膜細(xì)胞樣品用于標(biāo)記–首先將細(xì)胞結(jié)構(gòu)、蛋白和核酸固定，然后使熒光染料和抗體滲入到細(xì)胞內(nèi)部，標(biāo)記目的靶點(diǎn)。封閉細(xì)胞樣品，防止熒光標(biāo)記物與研究無關(guān)的蛋白非特異性結(jié)合，較大限度提高信噪比。蛋白封閉液有助于減少非特異染色?？贵w能夠取代封閉蛋白與其表位形成高親和力結(jié)合，而封閉液可防止樣品中的低親和力結(jié)合。早期的免疫熒光技術(shù)是將抗體與示蹤物質(zhì)結(jié)合，用于定位組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原物質(zhì)。collagen3免疫檢測免疫熒光Coons等于1941年初次采用熒光素進(jìn)行標(biāo)記而...

細(xì)胞的固定及免疫熒光：注意事項(xiàng)：（1）取細(xì)胞爬片時(shí)，動(dòng)作應(yīng)輕柔，防止將細(xì)胞爬片夾碎，影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)程。（2）種細(xì)胞過程中，要注意將細(xì)胞輕柔混勻，“八”字或者“十”字形搖晃，防止細(xì)胞局部生長過密。（3）稀釋、加二抗（熒光抗體）及此后的洗滌過程中注意避光。（4）細(xì)胞爬片進(jìn)行免疫熒光之后，需要盡快拍照，防止免疫熒光淬滅。或者放于暗盒內(nèi)，暫時(shí)保存于4度冰箱，盡快拍照。（5）在進(jìn)行熒光顯微鏡拍照時(shí)，要根據(jù)熒光抗體選擇合適的激發(fā)光源。PI/DAPI能將凋亡和未凋亡的細(xì)胞都染成紅色/藍(lán)色，只在凋亡的細(xì)胞核中才有FITC-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光。免疫熒光技術(shù)可以用于研究遺傳疾病和基因表達(dá)調(diào)控。CD36...

zo-1的免疫熒光，步驟如下：1.細(xì)胞在蓋片上生長融合到95%-100%時(shí)，從孵箱中取出。2.用預(yù)溫的1×PBS洗3次，每次10分鐘。3.4%的甲醛室溫固定20-30分鐘。4.1×PBS洗3次，每次10分鐘。5.0.2%TritonX-100透化2-5分鐘。6.1×PBS洗3次，每次10分鐘。7.5%BSA室溫封閉30分鐘。8.加一抗（用1%BSA稀釋）放在濕盒里，4度過夜。9.1×PBS洗3次，每次10分鐘。10.加二抗(用1%BSA稀釋)30分鐘，閉光。11.1×PBS洗3次，每次10分鐘。12.95%甘油封片。注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀釋。免疫熒光技術(shù)...