免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟：1.樣本準(zhǔn)備：細(xì)胞或薄組織。對(duì)單層生長(zhǎng)細(xì)胞，在傳代培養(yǎng)時(shí)，將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過(guò)的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞接近長(zhǎng)成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次；對(duì)懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞，用PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次，用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片。2.固定：取適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭颖?。一般?%PFA固定4℃過(guò)夜。固定完畢后的樣本可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個(gè)月。3.洗滌：PBS洗滌5min*3次。4.打孔：選擇合適的通透劑處理樣本，目的是使抗體更容易進(jìn)入細(xì)胞與抗原結(jié)合。在實(shí)際工作中，熒光抗原技術(shù)應(yīng)用較少，因此通常將其稱為熒光抗體技術(shù)或免疫熒...

細(xì)胞的固定及免疫熒光：注意事項(xiàng)：（1）取細(xì)胞爬片時(shí)，動(dòng)作應(yīng)輕柔，防止將細(xì)胞爬片夾碎，影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)程。（2）種細(xì)胞過(guò)程中，要注意將細(xì)胞輕柔混勻，“八”字或者“十”字形搖晃，防止細(xì)胞局部生長(zhǎng)過(guò)密。（3）稀釋、加二抗（熒光抗體）及此后的洗滌過(guò)程中注意避光。（4）細(xì)胞爬片進(jìn)行免疫熒光之后，需要盡快拍照，防止免疫熒光淬滅。或者放于暗盒內(nèi)，暫時(shí)保存于4度冰箱，盡快拍照。（5）在進(jìn)行熒光顯微鏡拍照時(shí)，要根據(jù)熒光抗體選擇合適的激發(fā)光源。PI/DAPI能將凋亡和未凋亡的細(xì)胞都染成紅色/藍(lán)色，只在凋亡的細(xì)胞核中才有FITC-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化等生...

免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟：1.樣本準(zhǔn)備：細(xì)胞或薄組織。對(duì)單層生長(zhǎng)細(xì)胞，在傳代培養(yǎng)時(shí)，將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過(guò)的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞接近長(zhǎng)成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次；對(duì)懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞，用PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次，用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片。2.固定：取適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭颖?。一般?%PFA固定4℃過(guò)夜。固定完畢后的樣本可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個(gè)月。3.洗滌：PBS洗滌5min*3次。4.打孔：選擇合適的通透劑處理樣本，目的是使抗體更容易進(jìn)入細(xì)胞與抗原結(jié)合。熒光抗體法是利用熒光標(biāo)記的抗體來(lái)追蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法。FOXP3免疫...

免疫熒光實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)：為了保證熒光染色的正確性，初次試驗(yàn)時(shí)需設(shè)置下述對(duì)照，以排除某些非特異性熒光染色的干擾。①標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照：標(biāo)本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。②特異性對(duì)照（抑制試驗(yàn)）：標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體，再加熒光標(biāo)記的特異性抗體。③陽(yáng)性對(duì)照：已知的陽(yáng)性標(biāo)本加熒光標(biāo)記的特異性抗體。如果標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照和特異性對(duì)照呈無(wú)熒光或弱熒光，陽(yáng)性對(duì)照和待檢標(biāo)本呈強(qiáng)熒光，則為特異性陽(yáng)性染色。一般標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過(guò)3min，就有熒光減弱現(xiàn)象，經(jīng)熒光染色的標(biāo)本較好在當(dāng)天觀察，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光強(qiáng)度會(huì)逐漸下降。免疫熒光技術(shù)可以用于研究食品安全和生物安全。P21免疫熒光檢查細(xì)胞...

細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：非特異性染色：是否滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；孵育過(guò)程中干片；抗原熱修復(fù)過(guò)度。染色過(guò)深：一抗?jié)舛冗^(guò)高；染色試濃度過(guò)高或孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；染色劑濃度過(guò)高或孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。通常實(shí)驗(yàn)室先固定細(xì)胞再進(jìn)行通透，但若檢測(cè)抗原是水不溶性蛋白，可先通透再固定，這樣可以通過(guò)通透去除一些水溶性蛋白，進(jìn)而可降低免疫熒光背景和非特異性信號(hào)；建議設(shè)陰性對(duì)照組，消除由于抗體非特異性結(jié)合而產(chǎn)生的背景染色；選擇醛類固定液時(shí)，保持其新鮮度，較好現(xiàn)配現(xiàn)用，使用不新鮮的醛類固定液自發(fā)熒光背景會(huì)升高。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化等生物學(xué)過(guò)程。BGLAP/OCN免疫熒光熒光的猝滅：熒光分子的輻射能...

通過(guò)不同顏色熒光標(biāo)記不同的靶標(biāo)，可以直觀的觀察同一樣品細(xì)胞內(nèi)不同結(jié)構(gòu)和蛋白。熒光標(biāo)記靶標(biāo)的方法主要包括熒光染料、免疫標(biāo)記、熒光融合蛋白等——這幾種方法均可選擇性標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)和蛋白，讓您在成像時(shí)更輕松地進(jìn)行觀察。細(xì)胞生物學(xué)采用的很多熒光工具基本上都是熒光基團(tuán)。這些熒光基團(tuán)經(jīng)過(guò)不同的方法修飾或結(jié)合到不同的分子上，從而具備了某些的功能與特定的細(xì)胞器或蛋白結(jié)合。通過(guò)化學(xué)修飾，單個(gè)熒光基團(tuán)可以產(chǎn)生許多變體形式，且每種變體都有不同的特異性。免疫熒光技術(shù)可以用于研究肉瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。HBSAg免疫基于熒光成像的技術(shù)對(duì)于查詢細(xì)胞和組織的結(jié)構(gòu)和功能方面非常有用。當(dāng)與免疫化學(xué)結(jié)合時(shí)，熒光成像技術(shù)的分析能力...

免疫熒光實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)：為了保證熒光染色的正確性，初次試驗(yàn)時(shí)需設(shè)置下述對(duì)照，以排除某些非特異性熒光染色的干擾。①標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照：標(biāo)本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。②特異性對(duì)照（抑制試驗(yàn)）：標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體，再加熒光標(biāo)記的特異性抗體。③陽(yáng)性對(duì)照：已知的陽(yáng)性標(biāo)本加熒光標(biāo)記的特異性抗體。如果標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照和特異性對(duì)照呈無(wú)熒光或弱熒光，陽(yáng)性對(duì)照和待檢標(biāo)本呈強(qiáng)熒光，則為特異性陽(yáng)性染色。一般標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過(guò)3min，就有熒光減弱現(xiàn)象，經(jīng)熒光染色的標(biāo)本較好在當(dāng)天觀察，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光強(qiáng)度會(huì)逐漸下降。熒光抗體標(biāo)記使得抗原定位變得可視化，有助于觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能。cy...

細(xì)胞和組織樣品處理：準(zhǔn)備熒光標(biāo)記的細(xì)胞樣品：為實(shí)現(xiàn)較佳的圖像質(zhì)量，首先應(yīng)建立針對(duì)目的蛋白和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的研究，同時(shí)將其他一切背景等排除在圖像之外。固定和破膜細(xì)胞樣品用于標(biāo)記–首先將細(xì)胞結(jié)構(gòu)、蛋白和核酸固定，然后使熒光染料和抗體滲入到細(xì)胞內(nèi)部，標(biāo)記目的靶點(diǎn)。封閉細(xì)胞樣品，防止熒光標(biāo)記物與研究無(wú)關(guān)的蛋白非特異性結(jié)合，較大限度提高信噪比。蛋白封閉液有助于減少非特異染色?？贵w能夠取代封閉蛋白與其表位形成高親和力結(jié)合，而封閉液可防止樣品中的低親和力結(jié)合。免疫熒光技術(shù)中，以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體來(lái)定位抗原物質(zhì)的方法被稱為熒光抗體技術(shù)。ZO-1免疫熒光試驗(yàn)免疫熒光通過(guò)抗體與示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)，進(jìn)而對(duì)...

熒光素標(biāo)記抗體的方法：方法及步驟：①抗體的準(zhǔn)備：取適量已知球蛋白濃度之溶液，置入三角燒瓶中，加入生理鹽水及碳酸鹽緩沖液，使然后蛋白濃度為20mg/ml，緩沖液容量為總量的1/10，混勻，將三角燒瓶置冰槽中，電磁攪拌（速度適當(dāng)以不起泡沫為宜）5～10min。②熒光素的準(zhǔn)備：根據(jù)欲標(biāo)記的蛋白質(zhì)總量，按每毫克蛋白加0.01mg熒光素，用分析天平準(zhǔn)確稱所取所需的異硫氰酸熒光素粉末。③結(jié)合（或稱標(biāo)記）：邊攪拌邊將稱取的熒光色素漸漸加入球蛋白溶液中，避免將熒光素粘于三角燒瓶壁或攪拌玻棒上（大約5～10min內(nèi)加完），加畢后，繼續(xù)攪拌12～18h。結(jié)合期間應(yīng)保持蛋白溶液于4℃左右，故須及時(shí)添冰去水；亦可將結(jié)...

免疫熒光法是將免疫學(xué)方法(抗原抗體特異結(jié)合)與熒光標(biāo)記技術(shù)結(jié)合起來(lái)研究特異蛋白抗原在細(xì)胞內(nèi)分布的方法。由于熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出，從而可對(duì)抗原進(jìn)行細(xì)胞定位。用免疫熒光技術(shù)顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細(xì)胞(或組織)化學(xué)技術(shù)。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物，再用這種熒光抗體(或抗原)作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)。在細(xì)胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光(黃綠色或桔紅色)，可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原...

細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：根據(jù)所檢測(cè)抗原所在位置來(lái)確認(rèn)是否需要加入 Triton 進(jìn)行通透。若所檢測(cè)抗原表位位于膜蛋白的白外段，則不需要通透；一般 5% BSA 封閉即可達(dá)到效果；從加熒光二抗起，后面所有操作步驟盡量避光?？s短在熒光顯微鏡下的觀察時(shí)間，1~2 h 為宜。染色后盡快熒光顯微鏡下觀察，若不能可放入 4 ℃ 冰箱避光保存一周。無(wú)/弱染色：烤片溫度過(guò)高，推薦 56~60 ℃ 1~2 h；一抗是否適用固定液和石蠟切片，使用濃度是否過(guò)低，孵育是否時(shí)間過(guò)短等。熒光抗體技術(shù)可以用于檢測(cè)和定位細(xì)胞或組織中的特定抗原物質(zhì)。collagenX(COL-10)免疫熒光檢查免疫熒光注意事項(xiàng)：對(duì)照實(shí)驗(yàn)的設(shè)...

熒光色素：異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC）為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，較大吸收光波長(zhǎng)為490495nm，較大發(fā)射光波長(zhǎng)520530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，結(jié)構(gòu)式如下：有兩種同分異結(jié)構(gòu)，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年，是應(yīng)用較普遍的熒光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是：①人眼對(duì)黃綠色較為敏感，②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。四乙基羅丹明（rhodamine，RIB200）為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精。性質(zhì)穩(wěn)定，可長(zhǎng)期保存。結(jié)構(gòu)式如下：較大吸收光波長(zhǎng)為570nm，較...

免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng)。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性，所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時(shí)，只要知道其中的一個(gè)因素，就可以查出另一個(gè)因素。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。在此基礎(chǔ)上又分為兩種方法：直接法和間接法。直接法：將標(biāo)記的特異性熒光抗體直接加到抗原上，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間反應(yīng)，即可結(jié)合并顯色。間接法：先用抗原的抗體（一抗）與抗原反應(yīng)結(jié)合，再用熒光標(biāo)記的二抗（一抗的抗體）與抗原反應(yīng)，形成抗體-抗原-抗體復(fù)合物。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化等生物學(xué)過(guò)程。TLR4免疫熒...

免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟：1.樣本準(zhǔn)備：細(xì)胞或薄組織。對(duì)單層生長(zhǎng)細(xì)胞，在傳代培養(yǎng)時(shí)，將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過(guò)的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞接近長(zhǎng)成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次；對(duì)懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞，用PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次，用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片。2.固定：取適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭颖?。一般?%PFA固定4℃過(guò)夜。固定完畢后的樣本可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個(gè)月。3.洗滌：PBS洗滌5min*3次。4.打孔：選擇合適的通透劑處理樣本，目的是使抗體更容易進(jìn)入細(xì)胞與抗原結(jié)合。免疫熒光技術(shù)可以用于研究植物病理學(xué)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。PDL-1/CD274免疫...

細(xì)胞和組織樣品處理：準(zhǔn)備熒光標(biāo)記的細(xì)胞樣品：為實(shí)現(xiàn)較佳的圖像質(zhì)量，首先應(yīng)建立針對(duì)目的蛋白和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的研究，同時(shí)將其他一切背景等排除在圖像之外。固定和破膜細(xì)胞樣品用于標(biāo)記–首先將細(xì)胞結(jié)構(gòu)、蛋白和核酸固定，然后使熒光染料和抗體滲入到細(xì)胞內(nèi)部，標(biāo)記目的靶點(diǎn)。封閉細(xì)胞樣品，防止熒光標(biāo)記物與研究無(wú)關(guān)的蛋白非特異性結(jié)合，較大限度提高信噪比。蛋白封閉液有助于減少非特異染色?？贵w能夠取代封閉蛋白與其表位形成高親和力結(jié)合，而封閉液可防止樣品中的低親和力結(jié)合。免疫熒光技術(shù)可以用于研究疾病的發(fā)生機(jī)制和醫(yī)治效果評(píng)估。HIF-1a免疫檢測(cè)細(xì)胞的固定及免疫熒光：1)吸除培養(yǎng)基，一般先加入PBS浸洗細(xì)胞 3 次，每次 5 ...

其他熒光物質(zhì)：1．酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無(wú)熒光效應(yīng)，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強(qiáng)熒光的物質(zhì)。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發(fā)出熒光，激發(fā)光波長(zhǎng)為360nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過(guò)氧化物酶的底物對(duì)羥基乙酸等。2．鑭系螯合物某些3價(jià)稀土鑭系元素如銪（Eu3+）、鋱（Tb3+）、鈰（Ce3+）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光，其中以Eu3+應(yīng)用較廣。Eu3+螯合物的激發(fā)光波長(zhǎng)范圍寬，發(fā)射光波長(zhǎng)范圍窄，熒光衰變時(shí)間長(zhǎng)，較適合用于分辨熒光免疫測(cè)定。所需要的儀器：熒光顯微鏡、顯微熒光分光光度計(jì)...

其他熒光物質(zhì)：酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無(wú)熒光效應(yīng)，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強(qiáng)熒光的物質(zhì)。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發(fā)出熒光，激發(fā)光波長(zhǎng)為360nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過(guò)氧化物酶的底物對(duì)羥基乙酸等。鑭系螯合物某些3價(jià)稀土鑭系元素如銪（Eu3）、鋱（Tb3）、鈰（Ce3）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光，其中以Eu3應(yīng)用較廣。Eu3螯合物的激發(fā)光波長(zhǎng)范圍寬，發(fā)射光波長(zhǎng)范圍窄，熒光衰變時(shí)間長(zhǎng)，較適合用于分辨熒光免疫測(cè)定。免疫熒光技術(shù)可以用于研究代謝疾病和內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能。bcl-2...

免疫熒光法是將免疫學(xué)方法(抗原抗體特異結(jié)合)與熒光標(biāo)記技術(shù)結(jié)合起來(lái)研究特異蛋白抗原在細(xì)胞內(nèi)分布的方法。由于熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出，從而可對(duì)抗原進(jìn)行細(xì)胞定位。用免疫熒光技術(shù)顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細(xì)胞(或組織)化學(xué)技術(shù)。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物，再用這種熒光抗體(或抗原)作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)。在細(xì)胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光(黃綠色或桔紅色)，可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原...

檢測(cè)復(fù)雜的生物學(xué)結(jié)構(gòu)需要較高清晰度的熒光信號(hào)，并將熒光信號(hào)從背景噪聲中分離開來(lái)。標(biāo)準(zhǔn)的免疫熒光標(biāo)記很少能夠獲得較佳信噪比的成像效果。獲得良好圖片和較佳的可供發(fā)表的高質(zhì)量圖像之間的差異就在于：需要精細(xì)調(diào)整樣品信號(hào)達(dá)到峰值特異性、高清晰度和較佳放大倍數(shù)。雖然熒光基團(tuán)是進(jìn)行高質(zhì)量細(xì)胞成像的較佳選擇，但不可避免地也極易發(fā)生光漂白，即熒光信號(hào)的光化學(xué)降解或衰退。任何光敏感度的下降都可能導(dǎo)致數(shù)據(jù)出現(xiàn)偏差，產(chǎn)生假性結(jié)果?？勾銣绶馄瑒┛梢员Ｗo(hù)熒光標(biāo)記蛋白的穩(wěn)定性，維持?jǐn)?shù)周乃至數(shù)月的圖像信號(hào)完整度。免疫熒光技術(shù)是將抗體與熒光素等示蹤物質(zhì)結(jié)合，通過(guò)抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行定位。P-AKT免疫熒光檢查直接免疫熒光：?jiǎn)慰贵w（...

細(xì)胞的固定及免疫熒光：1)吸除培養(yǎng)基，一般先加入PBS浸洗細(xì)胞 3 次，每次 5 min。2)向孔內(nèi)加入4%多聚甲醛1ml，進(jìn)行細(xì)胞固定，室溫固定20分鐘。3)吸去多聚甲醛，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。4)向孔內(nèi)加入0.5%Triton X-100(PBS配制)室溫通透20min，目的是使細(xì)胞通透。5) 除去Triton X-100，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。6)用10%的與二抗同源的山羊血清(PBS配制)或者5%BSA封閉2小時(shí)（選擇的封閉液與后面操作過(guò)程中抗體稀釋液一致）。封閉后不需要用PBS清洗。7)吸去封閉液，向每孔滴加足夠量適宜濃度的一抗（一次使用抗體可...

免疫熒光-實(shí)驗(yàn)步驟：細(xì)胞爬片免疫熒光：在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的玻片用PBS浸洗3次,每次5min;（圓蓋片：13mm24孔；18mm12孔；20mm6孔）用4%的多聚甲醛固定爬片15min,PBS浸洗玻片3次,每次5min0.5%TritonX-100(PBS配制)室溫通透20min(細(xì)胞膜上表達(dá)的抗原省略此步驟);PBS浸洗玻片3次,每次3min,吸水紙吸干PBS,在玻片上滴加3%的BSA（PBS配置）,室溫封閉30min5,吸水紙吸掉封閉液,不洗,每張玻片滴加足夠量用PBS稀釋好的一抗并放入濕盒,4℃孵育過(guò)夜。加熒光二抗:PBS浸洗爬片3次,每次5min,吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋...

免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)。很早以來(lái)就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。免疫熒光技術(shù)是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種．它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)。Coons等于1941年初次采用熒光素進(jìn)行標(biāo)記抗體獲得成功。經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展，該技術(shù)已相當(dāng)成熟。用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù)。在實(shí)際工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用，所...

熒光物質(zhì)，熒光色素：許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機(jī)化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有：⑴異硫氰酸熒光素為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，較大吸收光波長(zhǎng)為490--495nm，較大發(fā)射光波長(zhǎng)520--530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，結(jié)構(gòu)式如下：有兩種同分異結(jié)構(gòu)，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年，是應(yīng)用較普遍的熒光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是：①人眼對(duì)黃綠色較為敏感，②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。⑵四乙基羅丹明為橘紅色粉末，不溶于水，易...

免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟：1.樣本準(zhǔn)備：細(xì)胞或薄組織。對(duì)單層生長(zhǎng)細(xì)胞，在傳代培養(yǎng)時(shí)，將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過(guò)的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞接近長(zhǎng)成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次；對(duì)懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞，用PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次，用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片。2.固定：取適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭颖尽Ｒ话阌?%PFA固定4℃過(guò)夜。固定完畢后的樣本可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個(gè)月。3.洗滌：PBS洗滌5min*3次。4.打孔：選擇合適的通透劑處理樣本，目的是使抗體更容易進(jìn)入細(xì)胞與抗原結(jié)合。免疫熒光技術(shù)可以用于研究動(dòng)物模型和藥物篩選。Histone H2A.X免...

熒光的猝滅：熒光分子的輻射能力在受到激發(fā)光較長(zhǎng)時(shí)間的照射后會(huì)減弱甚至猝滅，這是由于激發(fā)態(tài)分子的電子不能回復(fù)到基態(tài)，所吸收的能量無(wú)法以熒光的形式發(fā)射。一些化合物有天然的熒光猝滅作用而被用作猝滅劑，以消除不需用的熒光。因此熒光物質(zhì)的保存應(yīng)注意避免光（特別是紫外光）的直接照射和與其他化合物的接觸。在熒光抗體技術(shù)中常用一些非熒的色素物質(zhì)如亞甲藍(lán)、堿性復(fù)紅。伊文思藍(lán)或低濃度的過(guò)錳酸鉀、碘溶液等對(duì)標(biāo)本進(jìn)行得當(dāng)復(fù)染，以減弱非特異性熒光本質(zhì)，使特異熒光更突出顯示。免疫熒光技術(shù)可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)分子，通過(guò)不同顏色的熒光染料進(jìn)行標(biāo)記。VWF免疫熒光熒光素標(biāo)記抗體的方法：方法及步驟：①抗體的準(zhǔn)備：取適量已知球蛋白...

熒光色素：異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC）為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，較大吸收光波長(zhǎng)為490495nm，較大發(fā)射光波長(zhǎng)520530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，結(jié)構(gòu)式如下：有兩種同分異結(jié)構(gòu)，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年，是應(yīng)用較普遍的熒光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是：①人眼對(duì)黃綠色較為敏感，②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。四乙基羅丹明（rhodamine，RIB200）為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精。性質(zhì)穩(wěn)定，可長(zhǎng)期保存。結(jié)構(gòu)式如下：較大吸收光波長(zhǎng)為570nm，較...

細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：根據(jù)所檢測(cè)抗原所在位置來(lái)確認(rèn)是否需要加入 Triton 進(jìn)行通透。若所檢測(cè)抗原表位位于膜蛋白的白外段，則不需要通透；一般 5% BSA 封閉即可達(dá)到效果；從加熒光二抗起，后面所有操作步驟盡量避光。縮短在熒光顯微鏡下的觀察時(shí)間，1~2 h 為宜。染色后盡快熒光顯微鏡下觀察，若不能可放入 4 ℃ 冰箱避光保存一周。無(wú)/弱染色：烤片溫度過(guò)高，推薦 56~60 ℃ 1~2 h；一抗是否適用固定液和石蠟切片，使用濃度是否過(guò)低，孵育是否時(shí)間過(guò)短等。免疫熒光技術(shù)可以用于研究神經(jīng)系統(tǒng)的功能和疾病。MEL-1A-R免疫檢測(cè)熒光抗體技術(shù)：抗原抗體反應(yīng)后，利用熒光顯微鏡判定結(jié)果的檢測(cè)方法。...

細(xì)胞免疫熒光主要用于蛋白定位研究和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞免疫熒光技術(shù)是利用免疫技術(shù)和熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，原理就是利用抗原-抗體反應(yīng)之后，采用熒光標(biāo)記，標(biāo)記完成后，顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)某種抗原成分的多少，從而做出一個(gè)定位研究，也可以為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)提供一個(gè)明確的指導(dǎo)，細(xì)胞免疫熒光具有敏感性強(qiáng)、特異性高、速度快的特點(diǎn)，是目前比較常用的組織學(xué)技術(shù)，也是比較精確的。免疫熒光染色的主要原理是利用抗原抗體之間的特異性結(jié)合來(lái)顯示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗結(jié)合，其次是帶有熒光基團(tuán)的二抗識(shí)別并結(jié)合一抗，熒光顯微鏡下即可觀察到熒光。熒光抗體技術(shù)可以用于檢測(cè)和定位細(xì)胞或組織中的特定抗原物質(zhì)。CD31免疫組化IHC其他...

細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：非特異性染色：是否滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；孵育過(guò)程中干片；抗原熱修復(fù)過(guò)度。染色過(guò)深：一抗?jié)舛冗^(guò)高；染色試濃度過(guò)高或孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；染色劑濃度過(guò)高或孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。通常實(shí)驗(yàn)室先固定細(xì)胞再進(jìn)行通透，但若檢測(cè)抗原是水不溶性蛋白，可先通透再固定，這樣可以通過(guò)通透去除一些水溶性蛋白，進(jìn)而可降低免疫熒光背景和非特異性信號(hào)；建議設(shè)陰性對(duì)照組，消除由于抗體非特異性結(jié)合而產(chǎn)生的背景染色；選擇醛類固定液時(shí)，保持其新鮮度，較好現(xiàn)配現(xiàn)用，使用不新鮮的醛類固定液自發(fā)熒光背景會(huì)升高。免疫熒光技術(shù)可以用于研究病毒傳播和免疫應(yīng)答。CK19免疫免疫熒光的原理和類型：免疫熒光利用熒光分子或熒光團(tuán)在一定波長(zhǎng)（分...

免疫熒光實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)：為了保證熒光染色的正確性，初次試驗(yàn)時(shí)需設(shè)置下述對(duì)照，以排除某些非特異性熒光染色的干擾。①標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照：標(biāo)本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。②特異性對(duì)照（抑制試驗(yàn)）：標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體，再加熒光標(biāo)記的特異性抗體。③陽(yáng)性對(duì)照：已知的陽(yáng)性標(biāo)本加熒光標(biāo)記的特異性抗體。如果標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照和特異性對(duì)照呈無(wú)熒光或弱熒光，陽(yáng)性對(duì)照和待檢標(biāo)本呈強(qiáng)熒光，則為特異性陽(yáng)性染色。一般標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過(guò)3min，就有熒光減弱現(xiàn)象，經(jīng)熒光染色的標(biāo)本較好在當(dāng)天觀察，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光強(qiáng)度會(huì)逐漸下降。免疫熒光技術(shù)可以用于研究食品安全和生物安全。PD-1免疫熒光試驗(yàn)熒...