上海正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家供應(yīng)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法：1.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法陽離子脂質(zhì)體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過靜電作用，將DNA分子包裹入內(nèi)，形成DNA脂復(fù)合物，也能被表面帶負(fù)電的細(xì)胞膜吸附，再通過融合或細(xì)胞內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中，是目前實(shí)驗(yàn)室較方便的轉(zhuǎn)染方法之一，其轉(zhuǎn)染率較高，優(yōu)于磷酸鈣法。由于脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞有一定的毒性，所以轉(zhuǎn)染時(shí)間一般不超過24小時(shí)。常用細(xì)胞類型：cos-7、BHK、NIH3T3、Hela等2.電穿孔轉(zhuǎn)染法電流能夠可逆地?fù)舸┘?xì)胞膜形成瞬時(shí)的水通路或膜上小孔促使DNA分子進(jìn)入胞內(nèi)，這種方法就是電穿孔。當(dāng)遇到某些脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率很低或幾乎無法轉(zhuǎn)入時(shí)建議用電穿孔法轉(zhuǎn)染。一般情況下，高電場(chǎng)強(qiáng)度會(huì)殺死50%-70%的細(xì)胞?，F(xiàn)在針對(duì)細(xì)胞死亡開發(fā)出了一種電轉(zhuǎn)保護(hù)劑，可以較大的降低細(xì)胞的死亡率，同時(shí)提高電穿孔轉(zhuǎn)染效率脂質(zhì)體可以和帶負(fù)電荷的核酸結(jié)合后重新形成復(fù)合物。上海正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家供應(yīng)

轉(zhuǎn)染的注意事項(xiàng)：培養(yǎng)基中的物品物品，比如青霉素和鏈霉素，是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些物品一般對(duì)于真核細(xì)胞無毒，但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性，使物品可以進(jìn)入細(xì)胞。這降低了細(xì)胞的活性，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低。所以，在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用物品，甚至在準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染前進(jìn)行細(xì)胞鋪板時(shí)也要避免使用物品。這樣，在轉(zhuǎn)染前也不必潤洗細(xì)胞。對(duì)于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素，因?yàn)檫@些物品是GENETICIN選擇性物品的競(jìng)爭(zhēng)性克制劑。無錫正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑生產(chǎn)廠家果觀察到轉(zhuǎn)染效率降低，可以試著轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細(xì)胞以恢復(fù)較佳結(jié)果。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染，你至少要掌握以下幾點(diǎn)：主要有下面幾種方法：：化學(xué)法：磷酸鈣法、DEAE-右旋糖苷法、陽離子脂質(zhì)體法；物理法：電穿孔法、顯微注射法、顆粒傳遞法；細(xì)菌介導(dǎo)法：逆轉(zhuǎn)錄細(xì)菌、腺細(xì)菌A.陽離子脂質(zhì)體法：帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞。特點(diǎn)：簡(jiǎn)單通用，適用性廣，轉(zhuǎn)染效率高，重復(fù)性好，但轉(zhuǎn)染時(shí)需除血清，轉(zhuǎn)染效率隨細(xì)胞類型變化大。由于脂質(zhì)體復(fù)合物與貼壁細(xì)胞的接觸機(jī)會(huì)遠(yuǎn)大于懸浮細(xì)胞，所以貼壁比懸浮轉(zhuǎn)染效率要高。懸浮細(xì)胞建議使用電穿孔法。B.電穿孔法：利用高壓電脈沖對(duì)細(xì)胞膜的干擾，使其形成利于核酸進(jìn)入的微孔。

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的篩選：生長(zhǎng)的細(xì)胞比不分裂的細(xì)胞更快的受到GENETICIN物品的影響。轉(zhuǎn)染后，在開始篩選前等待48-72小時(shí)，使細(xì)胞表達(dá)足夠量的抗性酶，保證在開始篩選時(shí)可以自我保護(hù)。轉(zhuǎn)染后48-72小時(shí)倒掉培養(yǎng)基，加入含有GENETICIN物品的培養(yǎng)基，物品的濃度根據(jù)劑量反應(yīng)曲線確定，足夠殺死未轉(zhuǎn)染細(xì)胞。因?yàn)樵S多因子影響到篩選所需的GENETICIN物品的較佳濃度，包括細(xì)胞類型，培養(yǎng)基和血清濃度等，所以有必要對(duì)每種細(xì)胞作一個(gè)劑量反應(yīng)曲線，確定較佳濃度。篩選較多可能需要一周時(shí)間，因?yàn)樵谥滤绖┝康腉ENETICIN物品存在條件下，細(xì)胞會(huì)分裂1-2次。在次培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)使用較低劑量的物品，一般是篩選劑量的一半。篩選后的細(xì)胞一般是離散的克隆，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?，可以分別純化（克?。?，收集進(jìn)行大量培養(yǎng)或染色并進(jìn)行抗性克隆的計(jì)數(shù)。加入混合液，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個(gè)小時(shí)。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染為什么不能加血清：傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染試劑一般會(huì)增加細(xì)胞的通透性，這樣會(huì)把血清中的成分帶入細(xì)胞，造成細(xì)胞毒性。陽離子脂質(zhì)體，轉(zhuǎn)染的過程是帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞。血清中含有大量的蛋白質(zhì)，在轉(zhuǎn)染過程中，帶負(fù)電的蛋白質(zhì)可能干擾陽離子脂質(zhì)體對(duì)核酸的吸附，影響轉(zhuǎn)染效率。同時(shí)，也會(huì)將血清中的蛋白帶入細(xì)胞，引發(fā)細(xì)胞毒性，故不能有血清轉(zhuǎn)染。這些轉(zhuǎn)染試劑要求在轉(zhuǎn)染前換無血清培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染后4-6h在更換成有血清培養(yǎng)基，這其實(shí)是為了減輕轉(zhuǎn)染造成的細(xì)胞毒性和轉(zhuǎn)染效率的降低。有血清時(shí)的轉(zhuǎn)染 血清一度曾被認(rèn)為會(huì)降低轉(zhuǎn)染效率。上海正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家推薦

一般的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 方法多采用脂質(zhì)體法。上海正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家供應(yīng)

影響轉(zhuǎn)染試驗(yàn)的因素：1.轉(zhuǎn)染試劑跟細(xì)胞系不匹配轉(zhuǎn)染試劑跟細(xì)胞系也是講究配合默契的，使用同一種試劑，不同細(xì)胞系轉(zhuǎn)染效率通常不同。但細(xì)胞系的選擇通常是根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要，因此在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求和細(xì)胞特性選擇適合的轉(zhuǎn)染試劑。每種轉(zhuǎn)染試劑都會(huì)提供一些已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株列表和文獻(xiàn)，通過這些資料可選擇較適合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)染試劑。當(dāng)然，較適合的是高效、低毒、方便、廉價(jià)的轉(zhuǎn)染試劑。因?yàn)橛行┘?xì)胞系是不穩(wěn)定的，可能隨著培養(yǎng)時(shí)間的改變，培養(yǎng)條件的不同，不同的選擇壓力，可能引起不同的克隆選擇。因此就算是同一個(gè)細(xì)胞系，在不同條件下轉(zhuǎn)染能力的差異可能會(huì)很大。上海正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家供應(yīng)

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