廈門北京細胞高效轉(zhuǎn)染試劑

細胞轉(zhuǎn)染的注意事項：1.細胞鋪板密度用于轉(zhuǎn)染的較佳細胞密度根據(jù)不同的細胞類型或應用而異。因轉(zhuǎn)染試劑對細胞有毒害作用，細胞太少，容易死。一般轉(zhuǎn)染時，貼壁細胞密度為70%-90%，懸浮細胞密度為2-4×106細胞/ml，確保轉(zhuǎn)染時細胞沒有長滿或處于靜止期。因為轉(zhuǎn)染效率對細胞密度很敏感，所以在不同實驗間保持一個基本的傳代步驟很重要。鋪板細胞數(shù)目的增加可以增加轉(zhuǎn)染活性和細胞產(chǎn)量。細胞的融合度必須要達到90%才能做啟動子的選擇獲得高轉(zhuǎn)染活性所需選擇的啟動子依賴于選用的細胞系和要表達的蛋白。CMV啟動子在大多數(shù)細胞類型中可以獲得高表達活性。同其他啟動子，如SV40和RSV(勞斯肉瘤細菌)相比，在BHK-21中其活性較高。這三種細菌啟動子在T細胞來源的細胞系，如Jurkat中組成表達水平較低。轉(zhuǎn)染后在培養(yǎng)基中加入PHA-L和PMA可以啟動Jurkat細胞中CMV啟動子，而單PMA就足以啟動KG1和K562(人骨髓瘤白細胞)中的CMV啟動子。SV40啟動子的表達在含有大T抗原(存在于COS-1和COS-7)時會提高，因為大T抗原可以刺激染色體外的合成。轉(zhuǎn)染技術轉(zhuǎn)染是將外源遺傳物質(zhì)導入真核細胞的過程，是細胞和分子生物學研究的重要工具。廈門北京細胞高效轉(zhuǎn)染試劑

細胞轉(zhuǎn)染的原理、操作步驟以及小技巧：一、脂質(zhì)體(Liposome)轉(zhuǎn)染方法原理脂質(zhì)體作為體內(nèi)和體外輸送載體的工具，已經(jīng)研究的十分普遍，中性脂質(zhì)體是利用脂質(zhì)膜包裹DNA，借助脂質(zhì)膜將DNA導入細胞膜內(nèi)。帶正電的陽離子脂質(zhì)體，DNA并沒有預先包埋在脂質(zhì)體中，而是帶負電的DNA自動結合到帶正電的脂質(zhì)體上，形成DNA-陽離子脂質(zhì)體復合物，從而吸附到帶負電的細胞膜表面，經(jīng)過內(nèi)吞被導入細胞。優(yōu)點:與其它方法相比，有較高的效率和較好的重復性，它適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細胞中，是目前條件下較方便的轉(zhuǎn)染方法之一。蘇州細胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家供應脂質(zhì)體可以和帶負電荷的核酸結合后重新形成復合物。

細胞轉(zhuǎn)染之PEI轉(zhuǎn)染法：1.細胞分盤：通過胰酶消化收集細胞，用適當?shù)耐耆囵B(yǎng)基以1×105至4×105細胞/cm2的密度平鋪細胞于35mm培養(yǎng)皿上（根據(jù)實驗需要選擇培養(yǎng)皿，使細胞貼壁后所占面積達到培養(yǎng)皿總面積的70－90％）。將細胞置于含5％CO2的37℃溫箱中孵育8-24h，當細胞貼壁完全后即可開始轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前2h換液（用1.5ml無血清培養(yǎng)基置換舊的培養(yǎng)基）。注：PEI轉(zhuǎn)染法對細胞生長有克制作用，在換液前細胞幾乎不生長，所以需要密度比較大時做轉(zhuǎn)染。2.制備PEI-DNA混合物以35mm組織培養(yǎng)皿用240μl反應總體積為例。先在無菌EP管中加入120μl1×HBS,再加入質(zhì)粒DNA（總量1-3μg為佳），混勻后加入等體積PEI工作液，充分混勻后室溫靜置20-30min，較后將這240μl的PEI-DNA混合液逐滴加入上述單層細胞的細胞培養(yǎng)基中，輕輕搖動平皿混勻后置于含5％CO2的37℃溫箱孵育。

細胞轉(zhuǎn)染實驗簡介：實驗原理外源基因進入細胞主要有四種方法：電擊法、磷酸鈣法和脂質(zhì)體介導法和細菌介導法。電擊法是在細胞上短時間暫時性的穿孔讓外源質(zhì)粒進入;磷酸鈣法和脂質(zhì)體法是利用不同的載體物質(zhì)攜帶質(zhì)粒通過直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因進入細胞;細菌法是利用包裝了外源基因的細菌傳染細胞的方法使得其進入細胞。但是由于電擊法和磷酸鈣法的實驗條件控制較嚴、難度較大;細菌法的前期準備較復雜、而且可能對于細胞有較大影響;所以現(xiàn)在對于很多普通細胞系，一般的瞬時轉(zhuǎn)染方法多采用脂質(zhì)體法通過實驗優(yōu)化合適的轉(zhuǎn)染條件對于轉(zhuǎn)染效率的提高很重要。

瞬時轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染效率的監(jiān)測：基因的瞬時表達在24-72小時內(nèi)就結束了。這種快速的瞬時表達非常適用于驗證質(zhì)粒表達和監(jiān)測轉(zhuǎn)染步驟的效率?？梢允褂脠蟾婊騺泶_定優(yōu)化條件，其表達蛋白易檢測，在目的細胞中不含此蛋白或水平很低。常用的報告基因包括氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT），綠色熒光蛋白（GFP），熒光素酶（Lux或Luc）以及b-半乳糖苷酶（b-gal）。可以使用簡單的非同位素方法檢測b-gal的表達以測定轉(zhuǎn)染效率和活性。pCMVSPORT-bgal質(zhì)粒包含CMV啟動子調(diào)控下的LacZ基因，轉(zhuǎn)染入真核細胞內(nèi)后可以直接表達bgal。結合簡單的檢測步驟，可以做為監(jiān)測轉(zhuǎn)染條件的一種方便靈敏的方法。大部分細胞可以在無血清培養(yǎng)基中幾個小時內(nèi)保持健康。杭州正規(guī)細胞高效轉(zhuǎn)染試劑單價

當復合物接近細胞膜時，通過內(nèi)吞作用形成內(nèi)體進入細胞。廈門北京細胞高效轉(zhuǎn)染試劑

轉(zhuǎn)染的注意事項：培養(yǎng)基中的物品物品，比如青霉素和鏈霉素，是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些物品一般對于真核細胞無毒，但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細胞的通透性，使物品可以進入細胞。這降低了細胞的活性，導致轉(zhuǎn)染效率低。所以，在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用物品，甚至在準備轉(zhuǎn)染前進行細胞鋪板時也要避免使用物品。這樣，在轉(zhuǎn)染前也不必潤洗細胞。對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素，因為這些物品是GENETICIN選擇性物品的競爭性克制劑。廈門北京細胞高效轉(zhuǎn)染試劑