深圳正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑哪里買

細(xì)胞轉(zhuǎn)染的原理、操作步驟以及小技巧：一、脂質(zhì)體(Liposome)轉(zhuǎn)染方法原理脂質(zhì)體作為體內(nèi)和體外輸送載體的工具，已經(jīng)研究的十分普遍，中性脂質(zhì)體是利用脂質(zhì)膜包裹DNA，借助脂質(zhì)膜將DNA導(dǎo)入細(xì)胞膜內(nèi)。帶正電的陽(yáng)離子脂質(zhì)體，DNA并沒有預(yù)先包埋在脂質(zhì)體中，而是帶負(fù)電的DNA自動(dòng)結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體上，形成DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，從而吸附到帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面，經(jīng)過內(nèi)吞被導(dǎo)入細(xì)胞。優(yōu)點(diǎn):與其它方法相比，有較高的效率和較好的重復(fù)性，它適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中，是目前條件下較方便的轉(zhuǎn)染方法之一。陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑，以其適用宿主范圍廣。深圳正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑哪里買

細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低下的幾個(gè)大坑：1.試劑過期有時(shí)候轉(zhuǎn)染效率低下，還要考慮會(huì)不會(huì)存在試劑過期的情況。毛博當(dāng)年做轉(zhuǎn)染整整半年，百思不得其解。較后發(fā)現(xiàn)，原來是Lipofectamine2000過期了。換了之后，立馬成功。根據(jù)我的經(jīng)驗(yàn)，盡量使用開封半年內(nèi)的，因?yàn)檫^了半年后，就算沒有過失效期，但是細(xì)胞毒性較大增加，而轉(zhuǎn)染效率卻較大下降。千萬不要為了省錢，影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)度哈。2.未加血清轉(zhuǎn)染后未及時(shí)加入血清，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡。一般要在轉(zhuǎn)染后的4-6小時(shí)換液且換為有血清的培養(yǎng)基。根據(jù)毛博的經(jīng)驗(yàn)，其實(shí)也可以在原來的無血清培養(yǎng)基里面滴加血清。這個(gè)時(shí)候，較好不要換液，不要打擾細(xì)胞，讓它安安靜靜地休息。但是也不能過早加入血清。過早的話，會(huì)引起未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞瘋狂生長(zhǎng)。那么，什么是較佳時(shí)機(jī)呢？在20%的細(xì)胞變圓的時(shí)候，就是加血清的較佳時(shí)機(jī)。徐州鄭州細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑到時(shí)后，根據(jù)細(xì)胞種類決定是否移除混合液。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率影響因素：1.細(xì)胞密度一般來說，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染可以取得較高的轉(zhuǎn)染效率，過低或過高都會(huì)影響轉(zhuǎn)染效果。2.細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)這點(diǎn)非常關(guān)鍵，很多時(shí)候傳代次數(shù)太少或者太多都將導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)染試劑敏感度的改變。因此，為了提高轉(zhuǎn)染效率以及轉(zhuǎn)染穩(wěn)定性、降低細(xì)胞毒性，應(yīng)盡量使用適度傳代的細(xì)胞系，并在不同次實(shí)驗(yàn)時(shí)保持細(xì)胞傳代次數(shù)的一致性。3.細(xì)胞種類不同細(xì)胞種類的細(xì)胞在做轉(zhuǎn)染時(shí)所需要的轉(zhuǎn)染體系是不同的，不能一種體系用在所有類型細(xì)胞的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

細(xì)胞電轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的幾點(diǎn)建議：1.電場(chǎng)強(qiáng)度要合適合適的電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)于電轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)非常重要，電場(chǎng)強(qiáng)度不能過高，過高會(huì)增加細(xì)胞的死亡率；也不能過低，過低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同細(xì)胞系具有不同的較佳場(chǎng)強(qiáng)值，實(shí)驗(yàn)前應(yīng)測(cè)定所轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的較佳電場(chǎng)強(qiáng)度。2.細(xì)胞狀態(tài)要好用于電轉(zhuǎn)的細(xì)胞一般選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞（15代以內(nèi)，傳代后2d）。因?yàn)樘幱趯?duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞分裂旺盛，表面結(jié)構(gòu)致密比穩(wěn)定期的細(xì)胞差，電轉(zhuǎn)后，細(xì)胞膜的恢復(fù)能力強(qiáng)，而且處于有絲分裂期的細(xì)胞更容易接受外源DNA.重新接種于培養(yǎng)皿或瓶，較好在轉(zhuǎn)染前4小時(shí)換一次新鮮培養(yǎng)液。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染，你至少要掌握以下幾點(diǎn)：主要有下面幾種方法：：化學(xué)法：磷酸鈣法、DEAE-右旋糖苷法、陽(yáng)離子脂質(zhì)體法；物理法：電穿孔法、顯微注射法、顆粒傳遞法；細(xì)菌介導(dǎo)法：逆轉(zhuǎn)錄細(xì)菌、腺細(xì)菌A.陽(yáng)離子脂質(zhì)體法：帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞。特點(diǎn)：簡(jiǎn)單通用，適用性廣，轉(zhuǎn)染效率高，重復(fù)性好，但轉(zhuǎn)染時(shí)需除血清，轉(zhuǎn)染效率隨細(xì)胞類型變化大。由于脂質(zhì)體復(fù)合物與貼壁細(xì)胞的接觸機(jī)會(huì)遠(yuǎn)大于懸浮細(xì)胞，所以貼壁比懸浮轉(zhuǎn)染效率要高。懸浮細(xì)胞建議使用電穿孔法。B.電穿孔法：利用高壓電脈沖對(duì)細(xì)胞膜的干擾，使其形成利于核酸進(jìn)入的微孔。細(xì)胞鋪板密度用于轉(zhuǎn)染的較佳細(xì)胞密度根據(jù)不同的細(xì)胞類型或應(yīng)用而異。深圳正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑哪里買

其可降解性對(duì)體內(nèi)應(yīng)用也具有重要的意義。深圳正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑哪里買

細(xì)胞轉(zhuǎn)染那些事兒：1.設(shè)置陰性和陽(yáng)性對(duì)照：一般在轉(zhuǎn)染后24-48h,靶基因即在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)?？梢罁?jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?4-48h后即可進(jìn)行靶基因表達(dá)的檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)。2.轉(zhuǎn)染后效率的檢測(cè)方法：觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光情況；qPCR驗(yàn)證；WB檢測(cè)敲減或過表達(dá)蛋白。3.轉(zhuǎn)染效率低，可采取以下兩種方法：1)復(fù)轉(zhuǎn)染，即轉(zhuǎn)染后12-24h再進(jìn)行轉(zhuǎn)染，前提是該細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)體的耐受性較好，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞死亡數(shù)較少。2)通過藥篩來殺死未轉(zhuǎn)入成功的細(xì)胞，前提是該質(zhì)粒帶有物品抗性的基因。4.電轉(zhuǎn)時(shí)，不同的細(xì)胞需要的電壓是不一樣的，需要做預(yù)實(shí)驗(yàn)，摸索較佳條件。對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞而言，較佳電壓位于250-1250v/cm。電擊后，應(yīng)該將DNA和細(xì)胞混合液在室溫下放置10min,使細(xì)胞恢復(fù)損傷。深圳正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑哪里買