昆明細胞高效轉(zhuǎn)染試劑生產(chǎn)廠家

細胞轉(zhuǎn)染的注意事項：1.細胞鋪板密度用于轉(zhuǎn)染的較佳細胞密度根據(jù)不同的細胞類型或應(yīng)用而異。因轉(zhuǎn)染試劑對細胞有毒害作用，細胞太少，容易死。一般轉(zhuǎn)染時，貼壁細胞密度為70%-90%，懸浮細胞密度為2-4×106細胞/ml，確保轉(zhuǎn)染時細胞沒有長滿或處于靜止期。因為轉(zhuǎn)染效率對細胞密度很敏感，所以在不同實驗間保持一個基本的傳代步驟很重要。鋪板細胞數(shù)目的增加可以增加轉(zhuǎn)染活性和細胞產(chǎn)量。細胞的融合度必須要達到90%才能做啟動子的選擇獲得高轉(zhuǎn)染活性所需選擇的啟動子依賴于選用的細胞系和要表達的蛋白。CMV啟動子在大多數(shù)細胞類型中可以獲得高表達活性。同其他啟動子，如SV40和RSV(勞斯肉瘤細菌)相比，在BHK-21中其活性較高。這三種細菌啟動子在T細胞來源的細胞系，如Jurkat中組成表達水平較低。轉(zhuǎn)染后在培養(yǎng)基中加入PHA-L和PMA可以啟動Jurkat細胞中CMV啟動子，而單PMA就足以啟動KG1和K562(人骨髓瘤白細胞)中的CMV啟動子。是目前實驗室較方便的轉(zhuǎn)染方法之一，其轉(zhuǎn)染率較高，優(yōu)于磷酸鈣法。昆明細胞高效轉(zhuǎn)染試劑生產(chǎn)廠家

細胞轉(zhuǎn)染效率影響因素：1.細胞密度一般來說，當細胞密度達到60%～80%時進行轉(zhuǎn)染可以取得較高的轉(zhuǎn)染效率，過低或過高都會影響轉(zhuǎn)染效果。2.細胞生長狀態(tài)這點非常關(guān)鍵，很多時候傳代次數(shù)太少或者太多都將導(dǎo)致細胞對轉(zhuǎn)染試劑敏感度的改變。因此，為了提高轉(zhuǎn)染效率以及轉(zhuǎn)染穩(wěn)定性、降低細胞毒性，應(yīng)盡量使用適度傳代的細胞系，并在不同次實驗時保持細胞傳代次數(shù)的一致性。3.細胞種類不同細胞種類的細胞在做轉(zhuǎn)染時所需要的轉(zhuǎn)染體系是不同的，不能一種體系用在所有類型細胞的轉(zhuǎn)染實驗。開封細胞高效轉(zhuǎn)染試劑直銷廠家瞬時轉(zhuǎn)染的細胞中，外源基因得以表達但它們并不會整合到細胞的基因組中。

細胞轉(zhuǎn)染效率低下的幾個大坑：1.不注意細節(jié)在轉(zhuǎn)染之前更換一次37℃預(yù)溫的培養(yǎng)基，可提高轉(zhuǎn)染效率。脂質(zhì)體和DNA/RNA混合物應(yīng)當一滴一滴地滴下來，從培養(yǎng)皿一邊滴到另一邊，邊滴邊輕搖培養(yǎng)皿，以確保均勻分布和避免局部高濃度。這些都是一些細枝末節(jié)，但是，如果不注意的話，也會造成轉(zhuǎn)染效率低下。2.細胞狀態(tài)不好細胞狀態(tài)不好，會導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低下。一般進行轉(zhuǎn)染的細胞應(yīng)該處于對數(shù)生長期。如果是貼壁細胞的話，貼壁率應(yīng)該在70-80%；如果是懸浮細胞的話，應(yīng)該是6X105個/孔（24孔板），一般是轉(zhuǎn)染前現(xiàn)在換液，轉(zhuǎn)染前用無血清培養(yǎng)基或PBS洗細胞一次。轉(zhuǎn)染的整個過程都不應(yīng)該有物品。

影響轉(zhuǎn)染試驗的因素：細胞狀態(tài)變化：（1）轉(zhuǎn)染試劑與細胞不匹配細胞轉(zhuǎn)染較適合的不是原代細胞，也不是傳代很多次的細胞。這是因為細胞培養(yǎng)在實驗室中保存數(shù)月和數(shù)年后會經(jīng)歷突變，總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化。這會導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細胞行為的變化。較適合轉(zhuǎn)染的細胞是經(jīng)過幾次傳代后達到對數(shù)生長期的細胞，細胞生長旺盛，較容易轉(zhuǎn)染。（2）把握時機沒錯！轉(zhuǎn)染也有適當?shù)臅r機，相比較非分裂細胞——分裂細胞往往要比靜止細胞更易于攝取并表達外源DNA。因此對大多數(shù)轉(zhuǎn)染操作而言，細胞都在轉(zhuǎn)染當天或前現(xiàn)在種板。同樣重要的是細胞在種板進行轉(zhuǎn)染時不應(yīng)處于過度生長的狀態(tài)，如細胞數(shù)量過多，互相疊加，營養(yǎng)物質(zhì)耗竭，代謝廢物積聚，轉(zhuǎn)染率低下也是很正常的！震蕩后將試劑放在－20攝氏度保存，使用前還需震蕩。

細胞轉(zhuǎn)染效率低下的幾個大坑：1.試劑過期有時候轉(zhuǎn)染效率低下，還要考慮會不會存在試劑過期的情況。毛博當年做轉(zhuǎn)染整整半年，百思不得其解。較后發(fā)現(xiàn)，原來是Lipofectamine2000過期了。換了之后，立馬成功。根據(jù)我的經(jīng)驗，盡量使用開封半年內(nèi)的，因為過了半年后，就算沒有過失效期，但是細胞毒性較大增加，而轉(zhuǎn)染效率卻較大下降。千萬不要為了省錢，影響實驗進度哈。2.未加血清轉(zhuǎn)染后未及時加入血清，會導(dǎo)致細胞大量死亡。一般要在轉(zhuǎn)染后的4-6小時換液且換為有血清的培養(yǎng)基。根據(jù)毛博的經(jīng)驗，其實也可以在原來的無血清培養(yǎng)基里面滴加血清。這個時候，較好不要換液，不要打擾細胞，讓它安安靜靜地休息。但是也不能過早加入血清。過早的話，會引起未轉(zhuǎn)染的細胞瘋狂生長。那么，什么是較佳時機呢？在20%的細胞變圓的時候，就是加血清的較佳時機。細胞鋪板密度用于轉(zhuǎn)染的較佳細胞密度根據(jù)不同的細胞類型或應(yīng)用而異。開封細胞高效轉(zhuǎn)染試劑直銷廠家

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細胞中。昆明細胞高效轉(zhuǎn)染試劑生產(chǎn)廠家

如何有效提高細胞轉(zhuǎn)染實驗效率：1.選擇高效的轉(zhuǎn)染方法不同轉(zhuǎn)染試劑有不同的轉(zhuǎn)染方法，但大多大同小異。轉(zhuǎn)染時應(yīng)跟據(jù)具體轉(zhuǎn)染試劑推薦的方法，但也要注意，因不同實驗室培養(yǎng)的細胞性質(zhì)不同，質(zhì)粒定量差異，操作手法上的差異等，其轉(zhuǎn)染效果可能不同，應(yīng)根據(jù)實驗室的具體條件來確定較佳轉(zhuǎn)染條件。2.確保所構(gòu)建載體的質(zhì)量。轉(zhuǎn)染載體的構(gòu)建（細菌載體，質(zhì)粒DNA，RNA，PCR產(chǎn)物，寡核苷酸等）也影響轉(zhuǎn)染結(jié)果。細菌載體對特定宿主細胞傳染效率較高，但不同細菌載體有其特定的宿主，有的還要求特定的細胞周期，如逆轉(zhuǎn)錄細菌需侵染分裂期的宿主細胞，此外還需考慮一些安全問題（如基因污染）。除載體構(gòu)建外，載體的形態(tài)及大小對轉(zhuǎn)染效率也有不同的影響，如前面提到的超螺旋及線性DNA對瞬時和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的影響。如果基因產(chǎn)物對細胞有毒性作用，轉(zhuǎn)染也很難進行，因此選擇組成或可調(diào)控，強度合適的啟動子也很重要，同時做空載體及其它基因的相同載體構(gòu)建的轉(zhuǎn)染正對照可排除毒性影響的干擾。昆明細胞高效轉(zhuǎn)染試劑生產(chǎn)廠家