寧波細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家

細(xì)胞轉(zhuǎn)染那些事兒：1.選擇傳代次數(shù)較低并處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。對(duì)大多數(shù)細(xì)胞而言，均需要在轉(zhuǎn)染當(dāng)天或前現(xiàn)在鋪板，第二天上午進(jìn)行轉(zhuǎn)染，48h后收集細(xì)胞進(jìn)行功能檢測(cè)。對(duì)于原代細(xì)胞，可用促有絲分裂刺激物進(jìn)行細(xì)胞活化。2.對(duì)于貼壁細(xì)胞，一般要求在轉(zhuǎn)染前一日，用胰酶處理為單細(xì)胞懸液，重新接種于培養(yǎng)皿或瓶，較好在轉(zhuǎn)染前4小時(shí)換一次新鮮培養(yǎng)液。3.支原體污染會(huì)嚴(yán)重降低細(xì)胞轉(zhuǎn)染的效率，且支原體不會(huì)像細(xì)菌污染那么明顯，因而轉(zhuǎn)染前可用環(huán)丙沙星處理細(xì)胞以除去支原體。對(duì)于真核生物，轉(zhuǎn)染就是原核生物中轉(zhuǎn)化的同義詞。寧波細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家

細(xì)胞轉(zhuǎn)染那些事兒：1.設(shè)置陰性和陽(yáng)性對(duì)照：一般在轉(zhuǎn)染后24-48h,靶基因即在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)?？梢罁?jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?4-48h后即可進(jìn)行靶基因表達(dá)的檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)。2.轉(zhuǎn)染后效率的檢測(cè)方法：觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光情況；qPCR驗(yàn)證；WB檢測(cè)敲減或過(guò)表達(dá)蛋白。3.轉(zhuǎn)染效率低，可采取以下兩種方法：1)復(fù)轉(zhuǎn)染，即轉(zhuǎn)染后12-24h再進(jìn)行轉(zhuǎn)染，前提是該細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)體的耐受性較好，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞死亡數(shù)較少。2)通過(guò)藥篩來(lái)殺死未轉(zhuǎn)入成功的細(xì)胞，前提是該質(zhì)粒帶有物品抗性的基因。4.電轉(zhuǎn)時(shí)，不同的細(xì)胞需要的電壓是不一樣的，需要做預(yù)實(shí)驗(yàn)，摸索較佳條件。對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞而言，較佳電壓位于250-1250v/cm。電擊后，應(yīng)該將DNA和細(xì)胞混合液在室溫下放置10min,使細(xì)胞恢復(fù)損傷。寧波細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家果觀察到轉(zhuǎn)染效率降低，可以試著轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細(xì)胞以恢復(fù)較佳結(jié)果。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率影響因素：1.細(xì)胞密度一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染可以取得較高的轉(zhuǎn)染效率，過(guò)低或過(guò)高都會(huì)影響轉(zhuǎn)染效果。2.細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)這點(diǎn)非常關(guān)鍵，很多時(shí)候傳代次數(shù)太少或者太多都將導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)染試劑敏感度的改變。因此，為了提高轉(zhuǎn)染效率以及轉(zhuǎn)染穩(wěn)定性、降低細(xì)胞毒性，應(yīng)盡量使用適度傳代的細(xì)胞系，并在不同次實(shí)驗(yàn)時(shí)保持細(xì)胞傳代次數(shù)的一致性。3.細(xì)胞種類不同細(xì)胞種類的細(xì)胞在做轉(zhuǎn)染時(shí)所需要的轉(zhuǎn)染體系是不同的，不能一種體系用在所有類型細(xì)胞的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染常用步驟：1.轉(zhuǎn)染試劑的準(zhǔn)備①將400ul去核酸酶水加入管中，震蕩10秒鐘，溶解脂狀物。②震蕩后將試劑放在－20攝氏度保存，使用前還需震蕩。2.選擇合適的混合比例(1：1－1：2/脂質(zhì)體體積：DNA質(zhì)量)來(lái)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在一個(gè)轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無(wú)血清培養(yǎng)基。加入合適質(zhì)量的MyoD或者EGFP的DNA，震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑，再次震蕩。3.將混合液在室溫放置10―15分鐘。4.吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS或者無(wú)血清培養(yǎng)基清洗一次。5.加入混合液，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個(gè)小時(shí)。6.到時(shí)后，根據(jù)細(xì)胞種類決定是否移除混合液，之后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24－48小時(shí)。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后，可在48h-72h細(xì)胞長(zhǎng)滿之后，提取細(xì)胞蛋白或者RNA。

轉(zhuǎn)染的注意事項(xiàng)：有血清時(shí)的轉(zhuǎn)染血清一度曾被認(rèn)為會(huì)降低轉(zhuǎn)染效率，但只要在DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物形成時(shí)不含血清，在轉(zhuǎn)染過(guò)程中是可以使用血清的。轉(zhuǎn)染過(guò)程在兩步中需要使用培養(yǎng)基做為稀釋液：在DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物準(zhǔn)備過(guò)程以及復(fù)合物同細(xì)胞接觸過(guò)程。在開始準(zhǔn)備DNA和陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑稀釋液時(shí)要使用無(wú)血清的培養(yǎng)基，因?yàn)檠鍟?huì)影響復(fù)合物的形成。但在復(fù)合物形成后，在加入細(xì)胞中前可以加入血清。陽(yáng)離子脂質(zhì)體和DNA的較佳量在使用血清時(shí)會(huì)有所不同，因此如果你想在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中加入血清需要對(duì)條件進(jìn)行優(yōu)化。大部分細(xì)胞可以在無(wú)血清培養(yǎng)基中幾個(gè)小時(shí)內(nèi)保持健康。對(duì)于對(duì)血清缺乏比較敏感的細(xì)胞，可以使用一些營(yíng)養(yǎng)豐富的無(wú)血清培養(yǎng)基，或者在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中使用血清。較適合轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是經(jīng)過(guò)幾次傳代后達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。開封細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑哪里買

轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)幾個(gè)名詞是從事生命科學(xué)研究的初學(xué)者經(jīng)常碰到的。寧波細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家

細(xì)胞轉(zhuǎn)染的注意事項(xiàng)：1.細(xì)胞鋪板密度用于轉(zhuǎn)染的較佳細(xì)胞密度根據(jù)不同的細(xì)胞類型或應(yīng)用而異。因轉(zhuǎn)染試劑對(duì)細(xì)胞有毒害作用，細(xì)胞太少，容易死。一般轉(zhuǎn)染時(shí)，貼壁細(xì)胞密度為70%-90%，懸浮細(xì)胞密度為2-4×106細(xì)胞/ml，確保轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞沒(méi)有長(zhǎng)滿或處于靜止期。因?yàn)檗D(zhuǎn)染效率對(duì)細(xì)胞密度很敏感，所以在不同實(shí)驗(yàn)間保持一個(gè)基本的傳代步驟很重要。鋪板細(xì)胞數(shù)目的增加可以增加轉(zhuǎn)染活性和細(xì)胞產(chǎn)量。細(xì)胞的融合度必須要達(dá)到90%才能做啟動(dòng)子的選擇獲得高轉(zhuǎn)染活性所需選擇的啟動(dòng)子依賴于選用的細(xì)胞系和要表達(dá)的蛋白。CMV啟動(dòng)子在大多數(shù)細(xì)胞類型中可以獲得高表達(dá)活性。同其他啟動(dòng)子，如SV40和RSV(勞斯肉瘤細(xì)菌)相比，在BHK-21中其活性較高。這三種細(xì)菌啟動(dòng)子在T細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞系，如Jurkat中組成表達(dá)水平較低。寧波細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家