寧波天津細胞高效轉(zhuǎn)染試劑

來源: 發(fā)布時間:2021-09-16

細胞電轉(zhuǎn)染實驗的幾點建議:1. 電場強度要合適合適的電場強度對于電轉(zhuǎn)染實驗非常重要,電場強度不能過高,過高會增加細胞的死亡率;也不能過低,過低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同細胞系具有不同的較佳場強值,實驗前應(yīng)測定所轉(zhuǎn)染細胞系的較佳電場強度。2. 細胞狀態(tài)要好用于電轉(zhuǎn)的細胞一般選取處于對數(shù)生長期的細胞(15代以內(nèi),傳代后2d)。因為處于對數(shù)生長期的細胞分裂旺盛,表面結(jié)構(gòu)致密比穩(wěn)定期的細胞差,電轉(zhuǎn)后,細胞膜的恢復(fù)能力強,而且處于有絲分裂期的細胞更容易接受外源DNA.對于原代細胞,可用促有絲分裂刺激物進行細胞活化。寧波天津細胞高效轉(zhuǎn)染試劑

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細胞轉(zhuǎn)染效率低下的幾個大坑:1. 細胞污染細胞污染也是造成細胞死亡,轉(zhuǎn)染效率低下的一大原因。首先,轉(zhuǎn)染細胞用的質(zhì)粒必須保證無菌。而現(xiàn)在市場上的一般的質(zhì)粒提取試劑盒都做不到較全無菌。毛博這里再貢獻一個獨門絕招:將提完質(zhì)粒后或者提的較后一步,用75%乙醇沉淀,這樣就除菌了。2.質(zhì)粒不行轉(zhuǎn)染用的質(zhì)粒首先要保證數(shù)量,一般為2 μg以上。質(zhì)粒純度不夠或者含有細菌LPS或其他對細胞有毒害作用的物質(zhì),也會影響轉(zhuǎn)染效率。這個時候,就應(yīng)該對質(zhì)粒進行純化和濃縮。天津正規(guī)細胞高效轉(zhuǎn)染試劑進貨價來指示細胞中目標(biāo)基因是否存在,這樣的報告基因一般可以在轉(zhuǎn)染后一兩天內(nèi)檢測到。

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如何高效率實現(xiàn)細胞轉(zhuǎn)染:DNA轉(zhuǎn)染導(dǎo)入細胞胞漿內(nèi)的DNA 不能穿過細胞核的核膜("核屏障")。在細胞有絲分裂過程中核膜溶解,DNA進入細胞核才有可能。為此,細胞處于分裂期對DNA轉(zhuǎn)染是至關(guān)重要的,并且處于分裂期的細胞比例必須盡可能大才能實現(xiàn)高效轉(zhuǎn)染。DNA轉(zhuǎn)染機制示意圖如下所示:轉(zhuǎn)染RNA(siRNA/miRNA/mRNA)對于RNA轉(zhuǎn)染是沒有"核屏障"的,因為RNA不需要進入細胞核發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng),因此細胞分裂對它沒有影響。轉(zhuǎn)染試劑的選擇理想的轉(zhuǎn)染試劑選擇可以使您的實驗如虎添翼!真核細胞的先天免疫系統(tǒng),使它們能夠檢測外來物質(zhì)如脂多糖、細菌或細菌核酸和蛋白質(zhì),并克制潛在病原體的入侵。此外,細胞通過信使分子向臨近細胞傳遞發(fā)現(xiàn)有害物質(zhì)的信號。因此,這些臨近細胞甚至無需接觸病原體即可采取防御方式。這種細胞先天免疫系統(tǒng)也是轉(zhuǎn)染成功的一個障礙。

DNA細胞轉(zhuǎn)染步驟:1.提前現(xiàn)在細胞鋪板 提前現(xiàn)在將細胞種植在24孔板中,以轉(zhuǎn)染時細胞密度在60%左右為宜。2.轉(zhuǎn)染過程⑴將0.8μg的DNA用25μl無血清稀釋液稀釋,充分混勻,制成DNA稀釋液。 注意:無血清稀釋液建議采用OPTI-MEM、無血清DMEM或1640。⑵將2μlEntransterTM-H4000用25μl無血清稀釋液體稀釋,充分混勻,制成EntransterTM-H4000稀釋液。室溫靜置5分鐘。⑶將EntransterTM-H4000稀釋液分別加入到DNA稀釋液中,充分混勻(可用振蕩器振蕩或用加樣器吹吸10次以上),室溫靜置15分鐘。轉(zhuǎn)染復(fù)合物制備完成。⑷將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到含細胞和完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器上,輕柔混勻。 注意:①對本試劑,采用含血清的全培養(yǎng)基有助于提升轉(zhuǎn)染效率。②完全培養(yǎng)基可加物品。一類是瞬時轉(zhuǎn)染,一類是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染(很長轉(zhuǎn)染)。

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瞬時轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染效率的監(jiān)測:基因的瞬時表達在24-72小時內(nèi)就結(jié)束了。這種快速的瞬時表達非常適用于驗證質(zhì)粒表達和監(jiān)測轉(zhuǎn)染步驟的效率??梢允褂脠蟾婊騺泶_定優(yōu)化條件,其表達蛋白易檢測,在目的細胞中不含此蛋白或水平很低。常用的報告基因包括氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT),綠色熒光蛋白(GFP),熒光素酶(Lux或Luc)以及b- 半乳糖苷酶(b-gal)??梢允褂煤唵蔚姆峭凰胤椒z測b-gal的表達以測定轉(zhuǎn)染效率和活性。pCMV SPORT- bgal質(zhì)粒包含CMV啟動子調(diào)控下的LacZ基因,轉(zhuǎn)染入真核細胞內(nèi)后可以直接表達bgal。結(jié)合簡單的檢測步驟,可以做為監(jiān)測轉(zhuǎn)染條件的一種方便靈敏的方法。在瞬時轉(zhuǎn)染質(zhì)粒中往往都含有一個報告基。鄭州細胞高效轉(zhuǎn)染試劑哪家好

當(dāng)復(fù)合物接近細胞膜時,通過內(nèi)吞作用形成內(nèi)體進入細胞。寧波天津細胞高效轉(zhuǎn)染試劑

細胞轉(zhuǎn)染的常用方法:磷酸鈣共沉淀原理:該法可用于瞬時或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。然而因其對pH、溫度和緩沖液鹽濃度的微小變化十分敏感,所得結(jié)果容易出現(xiàn)差異,且對許多類型的細胞培養(yǎng)物(尤其是原代細胞)具有細胞毒性,轉(zhuǎn)染效率較差。實驗步驟:將核酸與氯化鈣在磷酸鹽緩沖液中混合,同時控制好pH、溫度等條件 → 室溫孵育,生成濃縮DNA的極小不溶性顆粒沉淀 → 將顆粒型沉淀分散到細胞中,促進DNA粘附在細胞表面 → 共沉淀通過內(nèi)吞作用進入胞漿 → 分析細胞瞬時基因表達或者選擇穩(wěn)定性傳染。寧波天津細胞高效轉(zhuǎn)染試劑

與原代細胞相關(guān)的擴展資料:

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原代細胞(primary culture cell)是指從機體取出后立即培養(yǎng)的細胞。有人把培養(yǎng)的第1代細胞與傳10代以內(nèi)的細胞統(tǒng)稱為原代 細胞培養(yǎng)。原代細胞不僅廣泛應(yīng)用于分子、 細胞生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究,如 蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)、 細胞株(系)研究、DNA,RNA和遺傳學(xué)研究等,還可應(yīng)用于當(dāng)今熱門的 生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)如 藥物篩選、 藥物代謝和毒理研究、**藥物的研究等。原代細胞在生物醫(yī)藥領(lǐng)域有不可替代性作用,市場前景廣闊。