國外2PPLUS雙光子顯微鏡成像技術(shù)

通過并行化不同激光波長的激光掃描，研究人員增加了在相同時間內(nèi)可以成像的體積，同時保持了高的時間和空間分辨率。研究人員通過引入兩種不同波長的鈣信號熒光探針，將神經(jīng)元群體的活動標(biāo)記為兩種不同的顏色，同時激發(fā)兩種不同波長的探針，從而實現(xiàn)了兩種顏色的并行數(shù)據(jù)記錄。為了實現(xiàn)三維空間成像，研究人員還在兩個激光束上配置了快速變焦系統(tǒng)，即一個電透鏡和一個空間光調(diào)制器。因此，可以以10Hz的速度同時記錄10個500微米和500微米的平面，覆蓋600微米的深度，覆蓋大腦皮層第二層到第五層的結(jié)構(gòu)，體積內(nèi)可以記錄2000多個神經(jīng)元。上海雙光子顯微鏡就找因斯蔻浦。國外2PPLUS雙光子顯微鏡成像技術(shù)

隨著技術(shù)的發(fā)展，雙光子顯微鏡的性能不斷優(yōu)化。結(jié)合其特點，大致可以分為兩個方面:深入和主動改進(jìn)。為了使激發(fā)激光進(jìn)入更深的層次，可以從器件優(yōu)化和標(biāo)本改造兩個方面入手。關(guān)于器件的優(yōu)化，我們可以把激光束做得更細(xì)，集中能量，讓激光穿透得更深。對于樣品，物質(zhì)的吸收和散射是影響光傳播的主要因素。為了解決這個問題，我們需要將樣本透明化。一種方法是用某種物質(zhì)浸泡標(biāo)本，使其中的物質(zhì)(主要是脂質(zhì))被破壞或溶解。另一種方法是通過電泳電解脂類，從而提高標(biāo)本的“透明度”。bruker雙光子顯微鏡成像視野是多少雙光子顯微鏡有這么多優(yōu)點，那么雙光子顯微鏡有哪些應(yīng)用呢？

第二代微型化雙光子熒光顯微鏡FHIRM-TPM2.0，其成像視野是該團隊于2017年發(fā)布的代微型化顯微鏡的7.8倍，同時具備三維成像能力，獲取了小鼠在自由運動行為中大腦三維區(qū)域內(nèi)上千個神經(jīng)元清晰穩(wěn)定的動態(tài)功能圖像，并且實現(xiàn)了針對同一批神經(jīng)元長達(dá)一個月的追蹤記錄。在一批“早鳥項目”中，該系統(tǒng)已被多個研究組應(yīng)用于不同的模式動物和行為范式，如小鼠的社交新穎性識別、斑胸草雀受調(diào)控后大腦特定神經(jīng)元變化、新型神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿探針的傳導(dǎo)適應(yīng)性分析以及獼猴三腦區(qū)成像等多項研究。

配合雙光子激發(fā)技術(shù)，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效。那么，什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢？在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子使電子躍遷到較高能級，經(jīng)過一個很短的時間后，電子再躍遷回低能級同時放出一個波長為長波長一半的光子（P=h/λ）。利用這個原理，便誕生了雙光子激發(fā)技術(shù)。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖激光，通過物鏡匯聚，由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，而物鏡焦點處的光子密度是比較高的，所以只有在焦點處才能發(fā)生雙光子激發(fā)，產(chǎn)生熒光，該點產(chǎn)生的熒光再次穿過物鏡，被光探頭接收，從而達(dá)到逐點掃描的效果。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖光，是通過物鏡匯聚的。

像差問題一直困擾著光學(xué)領(lǐng)域的工作者。像差會使光波前發(fā)生形變，不僅降低成像的信噪比和分辨率，使得很多時候我們只能“霧里看花”，更甚者，產(chǎn)生贗像，或無法獲得有意義的圖像。像差問題對雙光子成像的影響尤為嚴(yán)重，因為在那里，熒光信號對入射光強度的依賴是平方關(guān)系，一旦入射光波前形變，不僅聚焦強度大幅下降，成像分辨率也急劇惡化。因此，如何解決像差問題，實現(xiàn)，例如小鼠大腦皮層，深層區(qū)域的高質(zhì)量成像成為光學(xué)成像發(fā)展中相當(dāng)有挑戰(zhàn)性的問題之一。雙光子顯微鏡的原理是什么？國外2PPLUS雙光子顯微鏡的成像視野

雙光子顯微鏡可精確穿透較厚標(biāo)本進(jìn)行定點、有生命體的觀察！國外2PPLUS雙光子顯微鏡成像技術(shù)

首先，雙光子成像采用波長范圍約在700~1000 nm的近紅外光激發(fā)，在組織中的散射系數(shù)較小，穿透性很好，因此非常適合厚樣本的觀察。同時，由于是近紅外光激發(fā)，也能避免樣品中激發(fā)波長較短的自發(fā)熒光物質(zhì)的干擾，可獲得較強的熒光信號（如下圖）。所以雙光子成像具有較深的穿透力和較小的光毒性。通常在活物腦組織中雙光子顯微鏡有效成像深度可達(dá)200~500 μm，能夠較好地進(jìn)行三維成像。雙光子成像的另一大優(yōu)勢在于精確的空間點聚焦性。一般條件下，物質(zhì)只會被單光子激發(fā)，只有在光子密度足夠高的情況下，物質(zhì)才會吸收兩個光子從而被激發(fā)，所以，雙光子只會在光子密度蕞高的物鏡焦點附近發(fā)生，很少產(chǎn)生焦平面外的雜散光（如下圖）。這種性質(zhì)既提高了成像質(zhì)量，也降低了樣本的光漂白、光損傷區(qū)域。基于這些優(yōu)勢，使得雙光子顯微鏡非常適合對活細(xì)胞、活組織進(jìn)行長時間在體成像。國外2PPLUS雙光子顯微鏡成像技術(shù)