國內熒光雙光子顯微鏡分辨率是多少

雙光子顯微鏡(2PM)可以對鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器進行亞細胞分辨率的成像，從而測量不透明腦深部的活動。成像膜的電壓變化可以直接反映神經(jīng)元的活動，但神經(jīng)元活動的速度對于常規(guī)的2PM來說太快了。目前，電壓成像主要由寬視場顯微鏡實現(xiàn)，但其空間分辨率較差，且只能在淺深度成像。因此，為了以高空間分辨率成像不透明腦中膜電壓的變化，需要將成像速率提高2PM。面向模塊輸出端的子脈沖序列可視為從虛擬光源陣列發(fā)出的光，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成空間分離和時間延遲的聚焦陣列。然后，該模塊被集成到一個帶有高速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的標準雙光子熒光顯微鏡中，如圖2所示。光源是重復頻率為1MHz的920nm激光器。FACED模塊可以產(chǎn)生80個脈沖焦點，脈沖時間間隔為2ns。這些焦點是虛擬源的圖像。虛光源越遠，物鏡處的光束尺寸越大，焦點越小。光束可以沿Y軸比沿X軸更好地填充物鏡，從而在X軸上產(chǎn)生0.82m和0.35m的橫向分辨率。雙光子顯微鏡能夠進行光裂解、光轉染和光損傷等光學操縱。國內熒光雙光子顯微鏡分辨率是多少

在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收兩個長波長的光子，然后發(fā)射出一個波長較短的光子，其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的（如下圖）。如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），在單光子激發(fā)時，在波長為350nm光的激發(fā)下發(fā)出450nm熒光；而在雙光子激發(fā)時，可采用750nm的激發(fā)光得到450nm熒光。由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，為了不損傷細胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，從而可以減少光漂白和光毒性帶來的不利影響。美國ultima2PPLUS雙光子顯微鏡成像視野是多少雙光子顯微鏡可以用于局部微蝕鐳射磨皮后的膠原重塑的檢測。

配合了雙光子激發(fā)技術，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效。那么什么是雙光子激發(fā)技術呢？在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子使電子躍遷到較高能級，經(jīng)過一個很短的時間后，電子再躍遷回低能級同時放出一個波長為長波長一半的光子（P=h/λ）。利用這個原理，便誕生了雙光子激發(fā)技術。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖激光，通過物鏡匯聚，由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，而物鏡焦點處的光子密度是比較高的，所以只有在焦點處才能發(fā)生雙光子激發(fā)，產(chǎn)生熒光，該點產(chǎn)生的熒光再穿過物鏡，被光探頭接收，從而達到逐點掃描的效果。

2020年12月22日，臨研所、病理科和科研處邀請北京大學王愛民副教授做了題目為“新一代微型雙光子顯微成像系統(tǒng)介紹及其在臨床醫(yī)療診斷”的學術報告。學術報告由臨研所醫(yī)學實驗研究平臺潘琳老師主持。王愛民，北京大學信息科學技術學院副教授，畢業(yè)于北京大學物理系，獲學士、碩士學位，后于英國巴斯大學物理系獲博士學位。該研究組研發(fā)的微型雙光子顯微鏡，第1次在國際上獲得了小鼠大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸清晰穩(wěn)定的動態(tài)信號，該成果獲得了2017年度“中國光學進展”和“中國科學進展”，并被NatureMethods評為2018年度“年度方法--無限制行為動物成像”。目前，該研究組正在研究新一代雙光子顯微成像技術在臨床診斷中的應用，為未來即時病理、離體組織檢測、術中診斷等提供新的影像手段和分析方法。雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖器。

共聚焦顯微可以呈現(xiàn)這么漂亮的圖像，是不是什么樣品都可以用共聚焦顯微鏡拍拍拍.....得到各種各樣清晰漂亮的圖像呢？答案是否定的，任何事物都有優(yōu)缺點，何況一臺儀器呢，共聚焦顯微鏡也是有自己的局限,共聚焦有哪些局限呢：1.共聚焦顯微鏡只能拍攝約200um以內的的樣品，對于厚的或者樣品不能進拍攝；2.共聚焦顯微鏡由于是逐點進行掃描，對樣品的光毒性還是比較大的，特別是拍攝活細胞樣品時就更容易對樣品進行淬滅；3.由于光照射的區(qū)域幾乎能通過這個Z軸的層面，所以對于空間定點光刺激的實驗定點位置就不是特別精確；并且激光共聚焦顯微鏡沒有純紫外進行激發(fā)，對于一些特殊激發(fā)波長的實驗，效率非常低。雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子，在經(jīng)過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后，發(fā)射出一個波長較短的光子；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，為了不損傷細胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖寬度只有100飛秒，而其周期可以達到80至100兆赫茲。對于顯微成像技術包含：寬場熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、轉盤共聚焦顯微鏡、雙光子顯微鏡。進口ultimainvestigator雙光子顯微鏡廠家有哪些

雙光子顯微鏡比單光子共聚焦顯微鏡較大的不同在于無須使用孔限制光學散射。國內熒光雙光子顯微鏡分辨率是多少

WinfriedDenk使用的第1個光源是染料飛秒激光(脈沖寬度100fs，可見光波長630nm)。染料激光雖然實驗室演示可以接受，但是使用起來不方便，所以離商業(yè)化還很遠。很快雙光子顯微鏡的標準光源變成了飛秒鈦寶石激光器。鈦寶石激光器除了具有固態(tài)光源的優(yōu)點外，還具有近紅外波長調諧范圍寬，而近紅外比可見光穿透更深，對生物樣品的損傷更小。下圖是Thorlabs的雙光子和三光子顯微鏡配置，鈦寶石飛秒可調諧激光器位于平臺左側。從雙光子到三光子科學家們正在從雙光子顯微鏡轉向三光子顯微鏡。1996年，ChrisXu在康奈爾大學(Denk的導師實驗室)讀博時發(fā)明了三光子顯微鏡。如果雙光子吸收是可行的，那么三光子似乎是自然的發(fā)展方向。三光子成像使用更長的波長，大約1.3和1.7微米，成像深度比雙光子更深。目前錄音大約2.2毫米，人的大腦皮層厚度大約4毫米。與雙光子顯微鏡相比，三光子需要使用更強、更短、重復率更低的激光脈沖，這是傳統(tǒng)的鈦寶石激光器很難滿足的，但對于摻鐿光纖飛秒光參量放大器，比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA)就非常容易。國內熒光雙光子顯微鏡分辨率是多少