上海MEM細胞培養(yǎng)基

    改造抗體的重鏈氨基酸序列如seqid**所示；或改造抗體的重鏈氨基酸序列如；或改造抗體的重鏈氨基酸序列如，輕鏈氨基酸序列如?？梢岳斫猓景l(fā)明的改造抗體不限于以上幾種，只要是經(jīng)過蛋白質(zhì)改造降低了與fc受體的親和力的細胞培養(yǎng)用抗體均可。細胞培養(yǎng)本發(fā)明一個實施方式的細胞培養(yǎng)方法，包括以下步驟：在培養(yǎng)體系中添加改造抗體；所述改造抗體為將互補決定區(qū)以外的區(qū)域經(jīng)過蛋白質(zhì)改造的細胞培養(yǎng)用抗體，所述改造抗體與fc受體的親和力低于未經(jīng)過蛋白質(zhì)改造的細胞培養(yǎng)用抗體與fc受體的親和力。在一些實施方式中，細胞類型為淋巴細胞、粒細胞、肥大細胞、dc細胞、巨噬細胞、單核細胞和血小板中的一種或多種。所述的細胞來源于人血液、**、手術(shù)切除的人實體*、腹水。可以是新鮮采集的靜脈血、臍帶血，也可以是冷凍保存的pbmc細胞?？梢岳斫?，細胞類型不限于此，只要培養(yǎng)體系中有部分細胞的表面表達fc受體皆可。在一些實施方式中，設(shè)計細胞生物學(xué)試驗以定量檢測改造抗體針對特定起始材料細胞群中目標(biāo)細胞的功能活力，這包括細胞擴增試驗、細胞毒性試驗、細胞殺傷試驗、細胞遷移試驗等。在一個具體的實施例中，用改造抗體來刺激人pbmc中t細胞(cd3+)的增殖，定量確定抗體的活力。減血清培養(yǎng)基減少了血清中的未知因素對細胞的影響。上海MEM細胞培養(yǎng)基

    加入無菌－谷氨酰胺溶液規(guī)定體積、無菌％（w/v）碳酸氫鈉溶液規(guī)定體積，加注射用水（20℃～30℃）至規(guī)定體積，混勻。(4)如果必要，用1mol/L氫氧化鈉溶液或1mol/L鹽酸溶液調(diào)pH至所需值。(5)溶液應(yīng)在2℃－8℃下避光保存。具體使用方法參照培養(yǎng)基包裝袋上的說明書1）細胞培養(yǎng)用水一般為三蒸水（經(jīng)石英蒸餾器蒸餾）或超純水，醫(yī)*生產(chǎn)上一般為注射用水。2）建議盡量選擇與所用量相匹配的包裝一次使用，因為包裝一旦打開，組分可能會變質(zhì)或因受潮而結(jié)團。3）溶解干粉培養(yǎng)基時先加入終體積90％－95％的培養(yǎng)用水，添加劑加完后再補足。4）如需添加的組分較多時，某一組分完全溶解后，再添加另一組分。5）待培養(yǎng)基完全溶解后再加入碳酸氫鈉，以免產(chǎn)生沉淀。6）所有成分完全溶解后，培養(yǎng)基應(yīng)立即過濾或高壓**，以免產(chǎn)生沉淀或有微生物污染。7）在過濾**時，一般情況下應(yīng)調(diào)pH比所需值低～，因過濾**后，pH值會升高約。8）在細胞培養(yǎng)過程中，建議不加或加少量的***，如血清的濃度較低則所加***的量也要相應(yīng)降低一些。9）建議用1NHCl或1NNaOH來調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH，因為用碳酸氫鈉來調(diào)對培養(yǎng)液的滲透壓影響比較大。**培養(yǎng)基的**方法主要有兩種，高壓**及**。與過濾相比，高壓**的工作強度小。湖南細胞培養(yǎng)基生產(chǎn)企業(yè)無酚紅培養(yǎng)基確保了細胞實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

    培養(yǎng)至第12～20天收獲細胞，計數(shù)。結(jié)果討論在一個為期12天的試驗中，志愿者1(do**)的pbmc在使用acd3-sh時可以擴增(圖9a，空心圓圈)，而使用okt3時可以擴增(圖9a，實心圓)。在對志愿者2(donor2)pbmc的19天擴增試驗中，分別是491倍和251倍(圖9b)。結(jié)果顯示，改造抗體acd3-sh具有更高的激發(fā)nkt細胞擴增的活力。培養(yǎng)實例3nk細胞特異性擴增和純度檢測本測試取志愿者提供的血樣，分離pbmc后平均分為2份，分別用改造獲得的改造抗體acd3-sh、acd16-sh和acd52-sh(試驗組)和原型抗體okt3、acd16-3g8和campath-1h(對照組)進行培養(yǎng)，并刺激人pbmc中nk細胞(cd3-cd16+cd56+)的增殖，通過對細胞成分分析來比較抗體組的功能。材料人靜脈血，基礎(chǔ)培養(yǎng)基x-vivo15(lonza，04-418q)，擴增培養(yǎng)基(x-vivo15，il-21000iu/ml)，人血清(genimi，100-512)。細胞培養(yǎng)和檢測方法分離pbmc細胞，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度到1e6/ml。加入試驗組或?qū)φ战M抗體、il-2(1000iu/ml)、人血清(5％)。在37℃、5％co2培養(yǎng)72小時。加入等體積的擴增培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時。之后每隔48小時取樣計數(shù)，用擴增培養(yǎng)基稀釋細胞至，繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)至第14天收獲細胞，用熒光抗體percpmouseanti-human-cd3(bdbiosciences。

    每支凍干品中加入1ml上述培養(yǎng)基使其充分溶解，(此培養(yǎng)基為msc-cm培養(yǎng)基原液)，然后用上述配制的10％fcs的dmem/f12培養(yǎng)基稀釋msc-cm1和msc-cm2，制備5倍和10倍的msc-cm1和msc-cm2的稀釋培養(yǎng)基。②培養(yǎng)的hdf細胞達到80～90％融合后，％胰酶-edta消化，消化后的細胞用10％fcsdmem/f12培養(yǎng)基以5×104/ml重懸細胞，并將其接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100μl，37℃5％co2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時；③24h后棄原培養(yǎng)液，各組分別加入100ul步驟①配制的msc-cm1和msc-cm2原液、5x和10x培養(yǎng)基，每個msc-cm設(shè)3個平行孔，同時設(shè)空白培養(yǎng)基和普通培養(yǎng)基孔為實驗對照。放入37℃5％co2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24h、48h、72h。④各觀察期終止時，按照試劑盒說明書加入10μl/孔mtt液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸去原液，加入100μl/孔產(chǎn)物溶解液。37度孵育4小時，取出震蕩10min，在酶標(biāo)儀上以570nm波長測定吸光度。由于mtt可以被活細胞內(nèi)的線粒體中的一些脫氫酶還原生成結(jié)晶狀的深紫色產(chǎn)物formazan。在特定溶劑(洗滌劑或dmso)存在的情況下，可以被完全溶解。然后通過酶標(biāo)儀可以測定570nm波長附近的吸光度。細胞增殖越多越快，則吸光度越高；本實驗重復(fù)3次。DMEM高糖培養(yǎng)基的配方適合大多數(shù)細胞類型。

    注射用重組人白介素-2)，基礎(chǔ)培養(yǎng)基x-vivo5(lonza，04-418q)，完全培養(yǎng)基(x-vivo5，il-21000iu/ml)，celltiteraqueousonesolution(promega，g3580，即mts溶液)，okt3(takarabio，t210)。準(zhǔn)備抗體濃度梯度取96孔平底細胞培養(yǎng)板，在孔內(nèi)加入100μl完全培養(yǎng)基。用完全培養(yǎng)基稀釋抗體至μg/ml，在第1列孔內(nèi)各加入100μl，混勻。從第1列向第11列孔內(nèi)做梯度稀釋(serialdilution)，即轉(zhuǎn)移100μl，混勻后，繼續(xù)向下一列轉(zhuǎn)移。**后，每個孔內(nèi)含100μl完全培養(yǎng)基，并形成了抗體的1:2稀釋梯度，從第1列的μg/ml到第11列的。細胞培養(yǎng)利用白細胞分離液分離人pbmc細胞，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基調(diào)整密度至3e5/ml。在96孔板第1列至第11列孔內(nèi)各加入100μl細胞懸液，混勻。**后，每個孔內(nèi)含200μl完全培養(yǎng)基和3e4細胞，并形成了抗體的1:2稀釋梯度，從第1列的800ng/ml到第11列的。在37℃、5％co2培養(yǎng)5天。數(shù)據(jù)采集和處理每個孔內(nèi)加入20μlmts溶液。將平板放入細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6小時。用酶標(biāo)儀讀取490nm吸收光值。對讀數(shù)取均值，再扣除空白(blank，即第12列讀數(shù)的均值)。以抗體濃度/od做semi-log曲線，用4參數(shù)擬合方法(fourparameterlogisticregression)計算ed50。結(jié)果討論acd3-sh的ed50為(圖8。無血清培養(yǎng)基適合于需要無血清環(huán)境的細胞系。江蘇1640RPMI細胞培養(yǎng)基供應(yīng)商家

F12培養(yǎng)基適用于復(fù)雜細胞培養(yǎng)實驗。上海MEM細胞培養(yǎng)基

    7.將細胞懸液吸入10ml離心管中。平衡后將離心管放入離心機中，以1000rpm/min離心5min。8.棄去上清液，加入適當(dāng)體積的培養(yǎng)液，用滴管輕輕吹打細胞制成細胞懸液。9.將細胞懸液吸出分裝至2-3個培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基旋緊瓶蓋。10.顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察細胞量，必要時計數(shù)。注意密度過小會影響傳代細胞的生長，傳代細胞的密度應(yīng)該不低于5×105/ml。***要做好標(biāo)記。11.繼續(xù)培養(yǎng)：用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶，適當(dāng)旋松瓶蓋，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代細胞2-4h后開始貼附在瓶壁上。注意事項：1.嚴格的無菌操作2.適度消化：消化的時間受消化液的種類、配制時間、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響，消化過程中應(yīng)該注意培養(yǎng)細胞形態(tài)的變化，一旦胞質(zhì)回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。細胞凍存具體操作：一、凍存前準(zhǔn)備1.準(zhǔn)備適量凍存管，做好標(biāo)記后置于4℃冰箱預(yù)冷；2.配制凍存液，一般為用培養(yǎng)液配制10%DMSO；3.梯度凍存盒。二、細胞凍存：1.按照細胞傳代步驟1-7操作制備細胞懸液并離心；2.棄去上清，加入適當(dāng)體積的凍存液，用滴管輕輕吹打細胞制成細胞懸液；3.將1ml細胞懸液加入加入之前已做好標(biāo)記的凍存管中并做好記錄。上海MEM細胞培養(yǎng)基