原代肝細(xì)胞的分離與培養(yǎng)采用Seglen門(mén)靜脈兩步灌流法及其改良方法分離小鼠原代肝細(xì)胞，多次低速離心純化肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，采用單層膠原培養(yǎng)法進(jìn)行體外培養(yǎng)[15-18]。具體操作：雄性C57BL/6J小鼠腹腔注射1%鈉(50mg/kg)麻醉后，浸泡于75%乙醇中消毒1～2min，在無(wú)菌條件下(超凈工作臺(tái)中)剪開(kāi)腹部并暴露下腔靜脈與肝門(mén)靜脈。將靜脈留置針插入下腔靜脈后，迅速剪斷肝門(mén)靜脈。用無(wú)鈣無(wú)鎂的PBS緩沖液(含EDTA)灌流約50mL，在整個(gè)過(guò)程中，灌流液的灌流速度保持在7～8mL/min，溫度保持在37℃左右。待肝臟血液排出，肝臟變白后，用IV型膠原酶緩沖液()進(jìn)行原位消化，灌注膠原酶時(shí)，先用鑷子夾閉肝門(mén)靜脈，待肝臟膨起后停頓30s再松開(kāi)鑷子，反復(fù)多次，共灌流約10mL，溫度保持在37℃左右。灌流結(jié)束后，迅速將肝臟從體腔中取出并轉(zhuǎn)移到含EDTA的預(yù)冷PBS緩沖液中洗去血污、摘除膽囊，隨后轉(zhuǎn)移至含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。用鑷子輕輕地撕開(kāi)包膜，夾住肝蒂輕輕晃動(dòng)使肝細(xì)胞充分釋放，收集肝細(xì)胞懸液，用200目細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾。濾液在4℃、500r/min低速離心3min，棄上清。細(xì)胞沉淀用4～5mL的PBS緩沖液重懸后在4℃、500r/min離心1min，重復(fù)清洗3次后，使用臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)細(xì)胞活率和產(chǎn)出。 上海中喬新舟的 原代肝細(xì)胞教學(xué)質(zhì)量可靠嗎？歡迎來(lái)電咨詢上海中喬新舟！海南火雞Turkey Hepatocytes原代肝細(xì)胞種類(lèi)
肝細(xì)胞作為細(xì)胞移植慢性肝衰竭的種子細(xì)胞以及作為藥物篩選的靶細(xì)胞，制備和培養(yǎng)大規(guī)模的、高活力的肝細(xì)胞是這些研究的基本環(huán)節(jié)。因此肝細(xì)胞的分離和培養(yǎng)技術(shù)正日益受到人們關(guān)注，成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。目前肝細(xì)胞的分離方法有機(jī)械分離法、螯合法和酶消化法等。機(jī)械法操作簡(jiǎn)單，但分離獲得的肝細(xì)胞數(shù)量少、活性差。howard創(chuàng)建了膠原酶灌流法，seglen進(jìn)一步將這種方法發(fā)展為兩步灌流法。膠原酶灌流法得到的肝細(xì)胞數(shù)量和活性都得到提高，灌流法廣泛應(yīng)用于大鼠、小鼠、犬和兔等動(dòng)物。但此方法對(duì)肝組織塊的體積要求較大，不適用于手術(shù)切除的不規(guī)則小塊人肝組織，無(wú)法滿足基礎(chǔ)研究中對(duì)人肝細(xì)胞的需求。因此，急需建立一種簡(jiǎn)單、高效的分離培養(yǎng)人原代肝細(xì)胞的技術(shù)。 貴州小鼠原代肝細(xì)胞原代肝細(xì)胞的價(jià)格分析。歡迎來(lái)電咨詢上海中喬新舟！
凍存：1.吸取傳代后的細(xì)胞懸液，離心，去除培養(yǎng)液，加入凍存液，分裝凍存管（凍存管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為（5～10）×106個(gè)/ml，2ml凍存管中一般放1～）。2.按步凍存冷凍保存方法一：標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序?yàn)榻禍厮俾?1～-2℃/min；當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時(shí)，可增至-5～-10℃/min；到-100℃時(shí)，則可迅速浸入液氮中。冷凍保存方法二：冷凍管置于已設(shè)定程序之程序降溫機(jī)中每分鐘降1～3℃至-80℃以下，再放入液氮長(zhǎng)期保存。復(fù)蘇：1.取出冷凍管，立即放入37℃水浴箱中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。2.打開(kāi)凍存管，將細(xì)胞懸液吸到離心管中。，棄去上清液。4.加適當(dāng)培養(yǎng)液后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng)，第二天觀察生長(zhǎng)情況。
細(xì)胞培養(yǎng)可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。直接從體內(nèi)獲取的組織細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)為原代培養(yǎng)；當(dāng)原代培養(yǎng)的細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后，則需要做再培養(yǎng)，即將培養(yǎng)的細(xì)胞分散后，從一個(gè)容器以1：2或其他比率轉(zhuǎn)移到另一個(gè)或幾個(gè)容器中擴(kuò)大培養(yǎng)，為傳代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)的累積次數(shù)就是細(xì)胞的代數(shù)。細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融，實(shí)驗(yàn)證明這樣可以比較大限度的保存細(xì)胞活力。目前細(xì)胞凍存多采用甘油或DMSO作保護(hù)劑，這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)采用快速融化的方法，這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損傷。 選擇 原代肝細(xì)胞有哪些方法？歡迎來(lái)電咨詢上海中喬新舟！
隨著人們飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變，脂肪肝的發(fā)病率也呈逐年升高趨勢(shì)。臨床上根據(jù)飲酒與否,將其分為非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholicfattyliverdisease,NAFLD)和酒精性脂肪性肝病(alcoholicfattyliverdisease,AFLD)2種類(lèi)型。NAFLD是指除酒精和其他已知致肝損傷因素外，以胰島素抵抗和肝細(xì)胞脂肪變性為主要特征的臨床病理綜合征。NAFLD涵蓋從單純性脂肪變性/非酒精性脂肪肝到非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞的過(guò)程[1-3]。據(jù)有關(guān)資料顯示，NAFLD在全世界范圍內(nèi)患病率是25%左右[4]，在亞洲地區(qū)的發(fā)病率甚至高達(dá)[5]，且呈逐年上升趨勢(shì)。在中國(guó)，NAFLD患病人數(shù)增長(zhǎng)迅速且呈低齡化發(fā)病趨勢(shì)，發(fā)病率約為，已成為只次于慢性病毒性肝炎的第二大肝病[6-7]，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。 原代肝細(xì)胞的選材要求是什么？上海中喬新舟告訴您。山西鴨 北京鴨原代肝細(xì)胞中喬新舟
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在原代肝細(xì)胞分離培養(yǎng)過(guò)程中有以下幾個(gè)關(guān)鍵操作要點(diǎn)：(1)灌流的溫度。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前需預(yù)熱PBS緩沖液(含EDTA)及IV型膠原酶，使其溫度保持在37℃，灌流開(kāi)始時(shí)從水浴鍋中取出。(2)灌流的方向。由于小鼠門(mén)靜脈較細(xì)，插管操作較困難，因此采用逆向灌流法，即在較粗的下腔靜脈插管，剪斷門(mén)靜脈，使灌流液與血液呈逆向灌流，提高了灌流的成功率及細(xì)胞獲取率[17]。(3)灌流的速度。灌流過(guò)程應(yīng)保持勻速、低速，灌流全程時(shí)間比較好控制在15min以內(nèi)。先灌流無(wú)鈣無(wú)鎂的PBS緩沖液(含EDTA)，灌流速度應(yīng)保持在7～8mL/min。再灌流IV型膠原酶進(jìn)行原位消化，灌注膠原酶時(shí)，采用間斷法，即用鑷子夾閉門(mén)靜脈，快速灌注酶至肝臟略膨起后，停頓30s，待液體排出肝臟回縮后，再次進(jìn)行推注，反復(fù)多次，灌注時(shí)間約為5min。(4)膠原酶的濃度。IV型膠原酶濃度為，采用間斷法灌流進(jìn)行原位消化時(shí)，每只小鼠肝臟只需10mL的IV型膠原酶，既提高了灌流效率又可避免膠原酶的浪費(fèi)。(5)鼠尾膠原蛋白I型的濃度。對(duì)于原代肝細(xì)胞體外難以培養(yǎng)的問(wèn)題，不同實(shí)驗(yàn)室建立了多種培養(yǎng)方法來(lái)維持其生物學(xué)活性，大多采用雙層膠原夾層培養(yǎng)法(膠原三明治培養(yǎng)法)[15]，本實(shí)驗(yàn)采用單層膠原培養(yǎng)法，六孔板中預(yù)鋪鼠尾膠原蛋白I型的濃度為。 海南火雞Turkey Hepatocytes原代肝細(xì)胞種類(lèi)
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1、原代細(xì)胞：ScienCell（中國(guó)區(qū)正規(guī)一級(jí)代理）人源和動(dòng)物源各種原代細(xì)胞。
2、培養(yǎng)基：原代細(xì)胞**低血清、無(wú)血清、無(wú)異源蛋白無(wú)動(dòng)物成分培養(yǎng)基。
3、細(xì)胞培養(yǎng)試劑：胎牛血清、原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞生長(zhǎng)因子、ELISA試劑盒、定量PCR芯片試劑盒、DNA/RNA及細(xì)胞裂解物等。
4、細(xì)胞系（株）：種類(lèi)豐富（1000余種），已通過(guò)STR鑒定；提供細(xì)胞株完全培養(yǎng)基。
5、自研產(chǎn)品：支原體檢測(cè)/qing除試劑盒、端粒酶檢測(cè)試劑盒、人源/動(dòng)物源ELISA試劑盒等系列產(chǎn)品。
6、技術(shù)服務(wù)：綠/紅色熒光蛋白標(biāo)記、熒光素酶標(biāo)記、慢bing毒介導(dǎo)基因沉默或過(guò)表達(dá)及穩(wěn)轉(zhuǎn)株的構(gòu)建，細(xì)菌基因敲除、細(xì)胞基因敲除、小鼠基因敲除、血管生成功能學(xué)實(shí)驗(yàn)。