Recombinant Mouse IL-10 Protein

來(lái)源: 發(fā)布時(shí)間:2024-10-30

重組的化膿性鏈球菌Cas9蛋白(SpCas9)是一種用于基因組編輯的核酸酶。它是CRISPR-Cas系統(tǒng)的一部分,該系統(tǒng)是一種細(xì)菌和古菌的適應(yīng)性免疫防御機(jī)制,能夠識(shí)別并切割入侵的外源核酸。Cas9蛋白在CRISPR系統(tǒng)中起到關(guān)鍵作用,它能夠識(shí)別特定的原間隔子相鄰基序(PAM),在引導(dǎo)RNA(gRNA)的引導(dǎo)下與目標(biāo)DNA結(jié)合并進(jìn)行切割。SpCas9蛋白由1053個(gè)氨基酸組成,相對(duì)較小的體積使其便于在體內(nèi)遞送,因此它在多種生物中都能進(jìn)行有效的基因組編輯。為了提高SpCas9的表達(dá)量和溶解度,研究人員采用了多種策略,例如使用GB1促溶標(biāo)簽和多重啟動(dòng)子策略,這些策略可以顯著提高蛋白的產(chǎn)量和活性,同時(shí)保持其功能活性不受影響。在基因編輯過(guò)程中,SpCas9與gRNA形成穩(wěn)定的核糖核的蛋白(RNP)復(fù)合物,通過(guò)gRNA與基因組DNA的序列匹配來(lái)識(shí)別目標(biāo)位點(diǎn),并在距離NGGPAM序列3個(gè)堿基以內(nèi)的位置切割DNA。為了增強(qiáng)SpCas9的基因組編輯效率,研究人員還開(kāi)發(fā)了嵌合融合蛋白,例如與5’至3’核酸外切酶重組J(RecJ)或GFP融合的SpyCas9蛋白,這些嵌合蛋白可以顯著提高靶向基因編輯效率,同時(shí)保持較低的脫靶效應(yīng)。

通過(guò)優(yōu)化crRNA的設(shè)計(jì),可以提高FnCas12a的特異性和靈敏度,例如在microRNA檢測(cè)中 。Recombinant Mouse IL-10 Protein

Recombinant Mouse IL-10 Protein,標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

NLS-Cas9-EGFPNuclease在基因編輯中提高特異性的策略包括:1.**核定位信號(hào)(NLS)**:NLS有助于Cas9蛋白快速定位到細(xì)胞核,這可以減少Cas9在細(xì)胞質(zhì)中的非特異性結(jié)合,從而降低脫靶效應(yīng)。2.**瞬時(shí)表達(dá)**:由于NLS-Cas9-EGFPNuclease是作為蛋白質(zhì)直接遞送的,它在細(xì)胞內(nèi)不會(huì)經(jīng)歷長(zhǎng)時(shí)間的表達(dá),這限制了Cas9的活性時(shí)間窗口,減少了長(zhǎng)時(shí)間存在導(dǎo)致的脫靶風(fēng)險(xiǎn)。3.**優(yōu)化gRNA設(shè)計(jì)**:精心設(shè)計(jì)的gRNA可以提高特異性,通過(guò)選擇與目標(biāo)基因特異性匹配的gRNA,可以減少Cas9在非目標(biāo)位點(diǎn)的切割。4.**使用高保真Cas9變體**:一些Cas9變體被設(shè)計(jì)為具有更高的特異性,通過(guò)突變Cas9蛋白的某些氨基酸,可以降低其在非目標(biāo)位點(diǎn)的活性。5.**熒光標(biāo)記(EGFP)**:EGFP標(biāo)簽不僅用于追蹤和分選,還可以幫助研究者通過(guò)熒光激起細(xì)胞分選(FACS)富集成功編輯的細(xì)胞,從而提高編輯特異性。6.**體外驗(yàn)證**:在實(shí)際進(jìn)行體內(nèi)基因編輯之前,可以通過(guò)體外DNA切割實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證gRNA的特異性和效率,篩選出比較好的gRNA。7.**使用PAM序列優(yōu)化**:通過(guò)選擇具有限制性PAM序列的gRNA,可以減少可能的脫靶位點(diǎn)。

Recombinant Canine PDGF R beta/CD140b Protein,His Tag在cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)中,Ultra-Long Master Mix 可以用來(lái)擴(kuò)增5'和3'末端的長(zhǎng)片段cDNA。

Recombinant Mouse IL-10 Protein,標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

SpCas9蛋白(來(lái)自化膿性鏈球菌的Cas9蛋白)在基因編輯中的主要作用是作為核酸酶,能夠精確地切割目標(biāo)DNA序列。以下是SpCas9在基因編輯中的幾個(gè)關(guān)鍵步驟和作用:1.**識(shí)別和結(jié)合**:SpCas9蛋白與一個(gè)單導(dǎo)向RNA(sgRNA)結(jié)合,形成RNP復(fù)合物。這個(gè)復(fù)合物能夠識(shí)別并結(jié)合到基因組中與sgRNA互補(bǔ)的特定DNA序列。2.**PAM序列識(shí)別**:SpCas9需要一個(gè)稱(chēng)為原間隔子相鄰基序(PAM)的特定序列作為識(shí)別目標(biāo)DNA的先決條件。對(duì)于SpCas9,這個(gè)PAM序列通常是5'-NGG-3'。3.**DNA切割**:一旦RNP復(fù)合物與目標(biāo)DNA結(jié)合,SpCas9就會(huì)在PAM序列的3個(gè)堿基對(duì)的上游位置切割DNA雙鏈,產(chǎn)生一個(gè)雙鏈斷裂(DSB)。4.**引發(fā)DNA修復(fù)**:DNA雙鏈斷裂觸發(fā)細(xì)胞的DNA修復(fù)機(jī)制,包括同源定向修復(fù)(HDR)和非同源末端連接(NHEJ)。研究人員可以利用這些修復(fù)機(jī)制來(lái)插入、刪除或替換特定的DNA序列。5.**基因修改**:通過(guò)HDR,可以在斷裂的DNA兩端引入特定的DNA模板,從而實(shí)現(xiàn)精確的基因編輯。而NHEJ通常會(huì)導(dǎo)致小的插入或缺失(indel),這可以用來(lái)產(chǎn)生基因的敲除或敲入。6.**提高編輯效率**:為了提高SpCas9的編輯效率,研究人員可能會(huì)使用優(yōu)化的sgRNA設(shè)計(jì)、蛋白質(zhì)工程或嵌合融合蛋白等策略。

在質(zhì)粒DNA提取過(guò)程中,確保DNA的完整性和活性至關(guān)重要,這通常涉及以下幾個(gè)關(guān)鍵因素:1.**溫和的裂解條件**:選擇適當(dāng)?shù)牧呀夥椒▽?duì)于保持DNA的完整性至關(guān)重要。對(duì)于大于15kb的質(zhì)粒DNA,應(yīng)采用溫和的裂解方法,如將細(xì)菌懸浮于等滲的葡萄糖溶液中,加入溶菌酶和EDTA破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜,以減少對(duì)質(zhì)粒DNA的機(jī)械剪切力,從而保護(hù)其完整性。2.**避免過(guò)度裂解**:在質(zhì)粒提取過(guò)程中,并非裂解時(shí)間越長(zhǎng)越好。過(guò)長(zhǎng)的裂解時(shí)間可能會(huì)造成基因組DNA片段的污染,影響質(zhì)粒的純度。3.**適當(dāng)?shù)南礈旌拖疵?*:在純化過(guò)程中,適當(dāng)?shù)南礈炜梢匀コ鞍踪|(zhì)和其他雜質(zhì),但過(guò)度洗滌可能會(huì)導(dǎo)致DNA的損失。洗脫步驟中,確保洗脫液完全浸潤(rùn)柱膜,以保證結(jié)合在柱膜上的質(zhì)粒得以充分洗脫,避免因洗脫體積過(guò)小而影響質(zhì)粒得率。4.**避免DNA的降解**:在提取過(guò)程中,添加核酸酶抑制劑可以防止DNA被核酸酶降解。同時(shí),避免長(zhǎng)時(shí)間將DNA暴露在室溫下,以及避免多次凍融循環(huán),這些都有助于保護(hù)DNA的完整性。5.**低溫操作**:盡量在低溫條件下進(jìn)行提取操作,以減少核酸酶的活性,從而保護(hù)DNA的完整性。

去泛素化酶可以去除泛素化標(biāo)記,這一步驟是泛素化過(guò)程的逆轉(zhuǎn)過(guò)程,它允許細(xì)胞對(duì)泛素化事件進(jìn)行精細(xì)調(diào)控。

Recombinant Mouse IL-10 Protein,標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

檢測(cè)重組EGFP(增強(qiáng)型綠色熒光蛋白)的活性和穩(wěn)定性通常涉及一系列生物化學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法。以下是一些常用的檢測(cè)方法:1.**SDS-PAGE電泳**:-通過(guò)SDS-PAGE電泳分析EGFP的純度和分子量。-觀察是否有蛋白質(zhì)降解或聚合的跡象。2.**WesternBlot**:-使用特異性的GFP抗體進(jìn)行Westernblot,以檢測(cè)EGFP蛋白的存在和大小。-可以評(píng)估EGFP的表達(dá)水平和純度。3.**熒光光譜分析**:-使用熒光光譜儀測(cè)量EGFP的激發(fā)和發(fā)射光譜。-評(píng)估熒光強(qiáng)度和比較大激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng),以確定其熒光特性。4.**流式細(xì)胞儀分析**:-如果EGFP融合蛋白表達(dá)在細(xì)胞中,可以使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞群體的熒光強(qiáng)度。-這有助于評(píng)估EGFP的表達(dá)水平和細(xì)胞內(nèi)分布。5.**熒光顯微鏡觀察**:-在熒光顯微鏡下觀察EGFP的亞細(xì)胞定位和表達(dá)模式。-通過(guò)時(shí)間序列成像,可以評(píng)估EGFP在活細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)變化和穩(wěn)定性。6.**熱穩(wěn)定性分析**:-通過(guò)逐漸升高溫度并測(cè)量熒光強(qiáng)度的變化,可以評(píng)估EGFP的熱穩(wěn)定性。-熱穩(wěn)定性差的EGFP可能會(huì)在高溫下迅速失去活性。7.**光穩(wěn)定性測(cè)試(光漂白實(shí)驗(yàn))**:-通過(guò)持續(xù)光照并監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度的下降(光漂白),可以評(píng)估EGFP的光穩(wěn)定性。泛素分子可以通過(guò)其內(nèi)部的賴氨酸殘基(如Lys48)與其他泛素分子形成多聚泛素鏈。Recombinant Biotinylated Mouse CDCP1 Protein,His-Avi Tag

泛素分子可以通過(guò)其內(nèi)部的賴氨酸殘基與其他泛素分子形成多聚泛素鏈,這一步驟通常由E3酶催化。Recombinant Mouse IL-10 Protein

PreScissionProtease(PSP)是一種由人鼻病毒14型的3C蛋白酶(humanrhinovirus(HRV)type143Cprotease)和GST組成的融合蛋白。它具有以下特點(diǎn):1.**特異性識(shí)別**:PreScissionProtease能在低溫下(4°C)特異識(shí)別短肽Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro,并在Gln和Gly氨基酸殘基之間進(jìn)行酶切。2.**依賴結(jié)構(gòu)**:底物的識(shí)別和切割不僅依賴于融合蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu),還依賴于融合蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。3.**分離GST標(biāo)簽**:它可以特異性的將pGEX-6P系列等載體表達(dá)出的帶有酶底物識(shí)別多肽序列融合蛋白的GST標(biāo)簽進(jìn)行分離。4.**表達(dá)宿主**:本品由大腸桿菌中重組表達(dá),并以無(wú)菌液體形式提供。5.**物理性質(zhì)**:分子量約為46kDa,物理外觀為無(wú)菌無(wú)色液體。6.**儲(chǔ)存緩沖液**:25mMTris-HCl(pH8.0),150mMNaCl,1mMEDTA,5mMDTT,50%(V/V)Glycerin。7.**酶切緩沖液**:10×酶切緩沖液為500mMTris-HCl(pH7.0),1.5MNaCl,10mMEDTA,10mMDTT。8.**純度**:經(jīng)SDS-PAGE及HPLC分析,純度大于95%。9.**酶活定義**:在5℃條件下反應(yīng)16小時(shí),能夠切割10μg的GST標(biāo)簽的融合蛋白達(dá)90%以上所需的酶量定義為一個(gè)活性單位。Recombinant Mouse IL-10 Protein