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細胞培養(yǎng)注意事項及常見問題解答：1、培養(yǎng)基的選擇依細胞種類而定。如果是從別的實驗室借來的細胞，較初階段一定要保持細胞原有的培養(yǎng)條件；特殊種類的細胞，比如內皮細胞，可以借鑒網上培養(yǎng)成功的條件，添加一些特定成分。2、液體培養(yǎng)基的保存條件應是冰箱4度冷藏。小六兒見過有的大實驗室細胞量多，一次性購買的培養(yǎng)基瓶數(shù)也多，有些人可能覺得-20冰箱保存時間會更久一些。但是經過冷凍后的培養(yǎng)基再溶化時，你會發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基的顏色發(fā)生變化，顏色變深，這就是培養(yǎng)基的PH值升高了。3、培養(yǎng)基中都含有大量的谷氨酰胺，用來合成細胞生長所需要的核酸和蛋白質。但是谷氨酰胺在溶液中不穩(wěn)定，保存4周后的培養(yǎng)基需要重新加入谷氨酰胺。所以盡量不要大批量購買培養(yǎng)，也不要一次配太多的培養(yǎng)基它們產生的有毒物質會影響原代細胞的生長。重慶正規(guī)原代細胞分離試劑盒廠家直銷

原代細胞的培養(yǎng)和維持：1.消化培養(yǎng)法2.懸浮細胞培養(yǎng)法對于懸浮生長的細胞，如白血病細胞、淋巴細胞、骨髓細胞、胸水和腹水中的細胞和免疫細胞無需消化，可采用低速離心分離，直接培養(yǎng)，或經淋巴細胞分層液分離后接種培養(yǎng)。3.部位培養(yǎng)部位培養(yǎng)是指從供體取得部位或組織塊后，不進行組織分離而直接在體外的特定環(huán)境條件下培養(yǎng)，部位培養(yǎng)可保持部位組織的相對完整性，可用于重點觀察細胞間的聯(lián)系、排列情況和相互影響，以及局部環(huán)境的生物調節(jié)作用。寧波原代細胞分離試劑盒報價多數(shù)細胞推薦的接種密度為每平方厘米5000個細胞。

原代細胞轉染操作步驟（以24孔培養(yǎng)板為例）：A.細胞接種：轉染前現(xiàn)在接種細胞，每孔500μl培養(yǎng)基（不可加物品），使細胞在轉染時密度在30-50%。B.siRNA-RFectPM混合物準備：1.6pmolsiRNA用50μl無血清培養(yǎng)基稀釋。2.2μlRFectPM用50μl無血清培養(yǎng)基稀釋。輕輕混勻，室溫孵育5min。注意：確保在25min內執(zhí)行第三步操作，不要過于延遲。3.孵育5min后，將siRNA稀釋液與RFectPM稀釋液混合（總體積100μl）。輕輕混勻，室溫孵育20min。C.將混合物加到培養(yǎng)的細胞內（完全培養(yǎng)基培養(yǎng)）：1.將100μl混合物加入培養(yǎng)孔內，培養(yǎng)孔內含有0.5ml培養(yǎng)的細胞。輕輕晃動培養(yǎng)板，混勻。2.37°C培養(yǎng)18-72h，檢測基因克制效果。如果需要，細胞培養(yǎng)4-6h時可以更換培養(yǎng)基，但不是必須。孵育時間的長短，取決于細胞類型、所干擾基因本身及分析方法?？稍O置不同的孵育時間進行實驗以確定較佳孵育時間。轉染實驗優(yōu)化:為了提高轉染效率，較好對轉染條件進行優(yōu)化，特別是開始使用。

原代細胞標準化培養(yǎng)：由于每種原代細胞培養(yǎng)的條件迥異，而且每個實驗室都摸索出自己的培養(yǎng)條件，而對于一個特定的組織塊，所用培養(yǎng)條件不一樣，得出的所需細胞族群就不一樣，因為每種組織塊都含有不同種類的細胞群，而每一種細胞群在所選定的培養(yǎng)條件下（比如所選蛋白分解酶的種類和條件，細胞因子的種類，基礎培養(yǎng)基的種類或者是培養(yǎng)時間長短）都會得出不同的結果。由于各實驗室采取不同的培養(yǎng)條件，即使是同一塊心組織就有可能造成A實驗室獲得30%的心肌細胞，70%其他種類細胞，而B實驗室卻能獲得70%所需心肌細胞，30%為成纖維、脂肪等種類。這樣的話，即使是做同一項目的實驗，就有可能得出相反的科學結論。因此，早在2004年，美國科學界就質疑之前以原代細胞為主的科研文章，并同時提出原代細胞標準化培養(yǎng)的概念很適合用于藥物測試、細胞分化和轉化等實驗研究。

原代細胞培養(yǎng)實驗室常規(guī)步驟為：1）將動物組織從機體中取出并消毒除去存留在組織上的細菌、細菌、等污染源，這些污染源將會所需培養(yǎng)的原代細胞凋亡、停止生長和繁殖直至死亡，因此整個原代細胞培養(yǎng)過程中較全在無菌狀態(tài)下進行。2）將組織塊在選定的蛋白酶溶液中浸泡20-30分鐘，通常在37C水浴里進行，而蛋白酶的選定取決于部位組織和所需細胞的類型，比如成骨、肌肉、心、肝等就需要用胰蛋白酶才能解而出單個細胞，但是對于腦組織和乳腺等軟組織，就只能用分解能力較弱的膠原蛋白酶，以免損傷分散出來的單個細胞。3）將分散而成的單個細胞置于合適的培養(yǎng)基（含有特殊細胞生長因子、添加劑以及血清，或者無血清培養(yǎng)基）中培養(yǎng)，使細胞得以生存、生長和繁殖，整個過程都是在無菌情況下操作。體外分裂增殖的速度較快，營養(yǎng)成分消耗大，換液時間隔一般較短。青島正規(guī)原代細胞分離試劑盒廠家推薦

原代內皮細胞和血管平滑肌細胞都需要添加L-谷氨酰胺和成纖維細胞生長因子。重慶正規(guī)原代細胞分離試劑盒廠家直銷

原代細胞應用困局：經過一次傳代后，原代細胞培養(yǎng)物就會成為二級細胞培養(yǎng)物，也稱為細胞株。然而，盡管稱為細胞株，但其壽命是有限的（除非如前所述永生化）。這種有限的分裂能力體內的細胞相似，一旦細胞在體內完全分化以發(fā)揮其特殊功能，細胞將停止增殖-這是固有的保護性衰老過程。此外，某些原代細胞有絲分裂后，無論是在體內或體外培養(yǎng)中都不增殖（例如，神經元，骨骼肌細胞，心肌細胞，周細胞，終末分化的肝細胞）。因此，每次進行實驗后，原代細胞培養(yǎng)都需要再次從新鮮的組織中解離。重慶正規(guī)原代細胞分離試劑盒廠家直銷